趙俊峰 鄭少斌 姜耀東 趙善超 楊旭凱

(河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450002)

腎癌是老年人常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制至今不清，多數(shù)研究顯示G250(又稱MN/CAⅨ)基因可誘導(dǎo)細(xì)胞惡性表型〔1〕，并參與了腎臟腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。因此通過基因重組技術(shù)抑制該基因的表達(dá)可能為腎臟腫瘤患者帶來曙光。本研究在成功構(gòu)建腎癌相關(guān)抗原G250siRNA表達(dá)載體的基礎(chǔ)上〔2〕，利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)阻斷G250基因表達(dá)，觀察了G250基因沉默對(duì)腎癌786-0細(xì)胞體內(nèi)成瘤及生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞株(以下稱腎癌786-0細(xì)胞)及大腸桿菌DH5α由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院泌尿外科保存。4～6周齡的12只BALB/c裸鼠為SPF級(jí)，體重15～20 g，雌雄各半，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在南方醫(yī)院SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基及RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO公司)，lipofectamineTM2000(Invitrogen公司)，G418及 DEPC(Sigma公司)，空質(zhì)粒 pRNATU6.1/Neo(GenScript公司)，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、T4 DNA連接酶、T4磷酸化酶、質(zhì)粒提取試劑盒、PBS(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA靶序列的設(shè)計(jì)和質(zhì)粒的構(gòu)建 G250 mRNA的全長(zhǎng)序列從NCBI基因庫(Genebank登錄號(hào):AJ010588)檢索得出。應(yīng)用Primer express軟件按照siRNA的設(shè)計(jì)原則尋找含21個(gè)堿基的特異性序列。在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇最有效的G250的siRNA片段，靶位點(diǎn)293～313，根據(jù)pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出特異性干擾片段的核苷酸序列:5'-GGATCCCATTTAGGCTTAACTTCAGGTATTGA TATCCGTACCTGAAGTTAAGCCTAAATTTTTTTCCAAAAGCTT-3'，5'-AAGCTTTTGGAA AAAAATTTAGGCTTAACTTCAGGTACGGATATCAATACCTGAAG TTAAGCCTAAATGGGATCC-3'。序列送由南京金思特公司合成。將退火后shRNA寡核酸雙鏈和pRNAT-U6.1/Neo酶切產(chǎn)物按3∶1混合，T4DNA連接酶27℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌。然后提取待測(cè)的重組質(zhì)粒。酶切鑒定正確后取1 ml轉(zhuǎn)化菌液，送金思特公司測(cè)序。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染及建立穩(wěn)定干擾G250基因抗性單克隆腎癌786-0細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI1640。轉(zhuǎn)染前24 h，傳代至24孔板，每孔 l.5×105個(gè)細(xì)胞。用LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6 h換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，根據(jù)G418對(duì)腎癌786-0細(xì)胞在14 d內(nèi)的殺滅效果，我們選擇600 μg/ml作為篩選濃度。篩選培養(yǎng)2 w后可見抗性克隆長(zhǎng)出，挑取單克隆轉(zhuǎn)入24孔板逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)，4 w左右可獲得穩(wěn)定干擾抗性單克隆。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組和建立腫瘤動(dòng)物模型 將皮下注射轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的腎癌細(xì)胞的(786-0/si-G250-0)裸鼠作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染RNA干擾片段細(xì)胞(786-0/si-G250-b)的為實(shí)驗(yàn)組，每組6只。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-0/si-G250-0和786-0/si-G250-b細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心收集，計(jì)數(shù)后分別重懸于無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，配制成每0.1 ml含5×106個(gè)腫瘤細(xì)胞的懸液，用1 ml注射器將0.1 ml細(xì)胞懸液皮下注射于BALB/c裸鼠背部皮下，每一個(gè)部位注射5×106個(gè)細(xì)胞的懸液。

1.2.4 腫瘤生長(zhǎng)情況監(jiān)測(cè) 自腫瘤細(xì)胞注射第10天起，每天觀察每組裸鼠成瘤時(shí)間、成瘤率，待腫瘤出現(xiàn)后每3天一次用毫米游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)、寬、高最大垂直直徑(mm)，分別以a、b、c表示，依據(jù)腫瘤體積計(jì)算公式:V(mm3)=a×b×c/2(mm3)(V:體積)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。在成瘤后的第3周處死裸鼠，然后測(cè)量腫瘤重量，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率:腫瘤生長(zhǎng)抑制率=(1－處理組腫瘤重量/對(duì)照組腫瘤重量)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以±s表示成瘤時(shí)間、腫瘤重量的比較采取兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，皮下成瘤實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 G250基因表達(dá)沉默對(duì)腎癌786-0細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響

將786-0/si-G250-0和786-0/si-G250-b細(xì)胞接種6只裸鼠均成瘤，成瘤率分別為100%。裸鼠腫瘤出現(xiàn)時(shí)間分別為(11±1.5)d和(15±2.4)d。顯示出實(shí)驗(yàn)組的成瘤時(shí)間較對(duì)照組延長(zhǎng)，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.381，P=0.007)，說明G250基因表達(dá)水平降低后腎癌786-0細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的成瘤能力受到抑制。

2.2 G250基因表達(dá)沉默對(duì)腎癌786-0細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的影響兩組裸鼠接種G250基因表達(dá)沉默前后的腎癌786-0細(xì)胞后，皮下腫瘤生長(zhǎng)情況見圖1。經(jīng)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間差異顯著(F=8.486，P=0.015)，細(xì)胞與時(shí)間的交互效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.883，P=0.032)，兩組細(xì)胞7個(gè)不同時(shí)間腫瘤生長(zhǎng)體積的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=84.836，P=0.000)，說明786-0/si-G250-0組細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力顯著強(qiáng)于786-0/si-G250-b組，并隨天數(shù)增加差異加大。

圖1 G250基因表達(dá)沉默對(duì)786-0細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響

2.3 各組裸鼠瘤重、抑瘤率 成瘤3 w后，處死裸鼠，切取腫塊稱取重量顯示:對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組裸鼠的腫瘤重量分別為(37.353±9.332)mg、(22.224 ±5.145)mg，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.475，P=0.006)。說明G250基因表達(dá)沉默后能抑制腎癌786-0細(xì)胞抑制鼠腫瘤的生長(zhǎng)，G250基因表達(dá)量下降65%時(shí)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制率為40.50%。

2.4 腫瘤組織病理改變 裸鼠成瘤組織經(jīng)HE染色病理切片鑒定均為透明細(xì)胞癌，癌細(xì)胞排列成腺管狀。癌細(xì)胞體積大，多邊形，輪廓清楚，胞漿富含脂質(zhì)、糖元而淡染呈空泡狀，核稍小而深染，圓形，位于邊緣或中央，形態(tài)不規(guī)則，可見明顯的腫瘤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組可見少量腫瘤壞死細(xì)胞。見圖2。

圖2 G250基因沉默后786-0細(xì)胞移植腫瘤的病理學(xué)改變(HE，×200)

3 討論

腎腫瘤是泌尿系最常見的惡性腫瘤，它起病隱襲，死亡率高。2009年美國(guó)統(tǒng)計(jì)新發(fā)腎腫瘤57 760例，12 980例死亡，占所有新發(fā)實(shí)體腫瘤的3%〔3〕。腎癌的發(fā)生發(fā)展與多種癌基因及抑癌基因的異常激活、表達(dá)有關(guān)。在眾多相關(guān)研究中，G250是公認(rèn)的較好的腎透明細(xì)胞癌腫瘤相關(guān)抗原，但是G250基因表達(dá)在腎透明細(xì)胞癌發(fā)病中的作用尚不明確，研究顯示G250基因可能是一種癌基因〔4〕，而且對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用〔5〕。為進(jìn)一步了解該基因在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，在成功設(shè)計(jì)構(gòu)建、篩選及鑒定G250基因有效siRNA干擾序列的基礎(chǔ)上，通過人工誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)G250基因持續(xù)穩(wěn)定的抑制，觀察了G250基因表達(dá)沉默后對(duì)腎癌786-0細(xì)胞體內(nèi)成瘤及生長(zhǎng)的影響。

研究顯示G250基因表達(dá)沉默后，腎癌786-0細(xì)胞成瘤時(shí)間較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，同一時(shí)期腫瘤體積較對(duì)照組明顯減小，腫瘤重量明顯輕于接種正常腎癌786-0細(xì)胞組，G250基因沉默對(duì)腎癌786-0細(xì)胞BALB/c裸鼠皮下移植瘤的成瘤抑制率為40.5%，說明G250基因沉默能有效抑制腎癌786-0細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，不僅進(jìn)一步證實(shí)G250基因在促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化方面有重要的作用〔6〕，也提示該基因的作用可能比我們目前了解的要多，需要進(jìn)一步探討。

由于觀察到G250基因表達(dá)沉默后，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞成瘤能力明顯下降，造成腫瘤生長(zhǎng)速度減慢，說明我們?cè)O(shè)計(jì)的小分子干擾RNA在體內(nèi)穩(wěn)定的發(fā)揮了作用，導(dǎo)致G250基因沉默，也證實(shí)了該技術(shù)的持久、高度特異和高效的抑制靶基因表達(dá)的優(yōu)勢(shì)〔7〕，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值和前景，同時(shí)也提示G250基因有望成為基因治療的靶點(diǎn)。

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