楊春燕 曹成珠 汪曉筠 朱艷媚 嚴(yán)云飛

青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001

肝病在藏區(qū)中被稱作“赤巴病”，在藏醫(yī)藥的經(jīng)典著作中赤巴病被列為三大疾病之首。由飲食、生活習(xí)慣、氣候條件、經(jīng)濟(jì)落后、性格影響和遺傳導(dǎo)致。七味紅花殊勝散治療肝病的主要機(jī)制是，活血化瘀改善肝臟微循環(huán)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用健康SD大鼠，由青海省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大鼠抗Caspase－3多克隆抗體由SantaCruz公司生產(chǎn);NO測試盒購于北京中山公司。

1.2 分組與取材方法

雄性大鼠40只隨機(jī)分成4組。①正常對照組10只;②缺血組10只;③缺血再灌組10只;④七味紅花殊勝散組10只。全麻下消除肝臟側(cè)支循環(huán)，用Pringle法使肝缺血［1］，建立全肝缺血再灌注模型。對照組麻醉后僅行開腹手術(shù)，而不阻斷入肝血流［2］。

1.3 Caspase－3免疫組織化學(xué)染色

采血后快速取出肝臟固定48h，①切片脫蠟至水，在PBS中搖洗;②3%甲醇－過氧化氫室溫下孵育，蒸餾水清洗，PBS搖洗;③10%血清工作液封閉抗原，37℃恒溫水浴鍋濕盒內(nèi)孵育;④加入抗Caspase－3抗體，4℃冰箱過夜;⑤PBS搖洗，加入生物素化二抗IgG，37℃恒溫水浴鍋濕盒內(nèi)孵育;⑥PBS中搖洗，加入辣根酶標(biāo)記液，37℃恒溫水浴鍋濕盒內(nèi)孵育;⑦PBS中搖洗，DAB顯色，自來水充分沖洗，終止顯色，中性樹膠封片。每例動物隨機(jī)選取5張切片于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 各組NO檢測 (結(jié)果見表1)。

表1 各組大鼠血清NO含量的變化()

表1 各組大鼠血清NO含量的變化()

注:*與再灌注組相比，P＜0.01。

組別 n NO(μmol/L)正常對照組 10 19.82±0.71*缺血組 10 17.43±1.28*再灌組 10 12.36±0.12七味紅花殊勝散組 10 16.51±1.49*

大鼠血清NO含量再灌組與正常組相比 (P＜0.05)，與七味紅花殊勝散組相比 (P＜0.05)。

2.2 各組肝細(xì)胞凋亡率及caspase－3陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) (s)(結(jié)果見表2)。

表2 各組肝細(xì)胞凋亡率及caspase－3陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)

表2 各組肝細(xì)胞凋亡率及caspase－3陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)

注:*與再灌注組相比，P＜0.01。

組別 n 細(xì)胞凋亡率% caspase－3(number/mm2)正常對照組 10 3.58±1.52 6.02±1.20*缺血組 10 7.86±2.13 9.43±1.68*再灌組 10 6.15±1.98 8.36±0.96七味紅花殊勝散組 10 4.51±2.09 6.21±1.49*

肝細(xì)胞凋亡率及caspase－3陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)再灌組與正常組相比 (P＜0.05)，與七味紅花殊勝散組相比 (P＜0.05)。

3 討論

缺血再灌注肝損傷 (HIRI)是肝臟和創(chuàng)傷外科疾病中常見的病理過程，也是導(dǎo)致術(shù)后肝功能衰竭或肝移植早期無功能的主要原因之一。缺血再灌注損傷過程中肝臟及肝外臟器會出現(xiàn)一系列代謝、結(jié)構(gòu)和功能的損傷，有時(shí)甚至引起肝功能衰竭及多器官功能衰竭。肝臟缺血再灌注損傷機(jī)制目前尚未完全闡明。近年來的研究表明，枯否氏細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是引起肝缺血再灌注損傷的關(guān)鍵細(xì)胞，它們激活時(shí)釋放出的外源性活性氧可致肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷，并增加黏附分子表達(dá)，致使血小板和中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，引起了肝臟微循環(huán)的障礙。這將直接影響到疾病的預(yù)后、手術(shù)成功率和病人的存活率。因此，對于肝臟缺血再灌注作用機(jī)制的研究，具有重要的臨床意義［3－4］。Caspase－3被認(rèn)為是 Caspase家族介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:肝缺血再灌注損傷時(shí)Caspase－3基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，說明缺血再灌注損傷產(chǎn)生的凋亡刺激信號激活了依賴于Caspase－3家族的細(xì)胞凋亡機(jī)制而誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，這與其他的相關(guān)報(bào)道基本一致［5］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:七味紅花殊勝散對肝損傷的保護(hù)作用可能主要與其保護(hù)抗氧化酶的活性，提高機(jī)體的抗氧化能力有關(guān);另外可引起細(xì)胞外Ca2+大量內(nèi)流，胞漿Ca2+是凋亡的第二信使，它激活蛋白激酶C等，從而激活凋亡相關(guān)基因，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡通道［6］。促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及解毒作用，減少了細(xì)胞損傷，并有促肝細(xì)胞再生、恢復(fù)肝功能的作用。

［1］袁林，楊建青，渚光平等.潘生丁對實(shí)驗(yàn)大鼠肝缺血再灌注損傷的影響［J］.腹部外科，2006，19(4):244－246.

［2］王永剛，葉啟發(fā)，齊海智.潘生丁對大鼠移植肝缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華現(xiàn)代手術(shù)學(xué)雜志，2006，10(6):412－414.

［3］彭松林，顧璽，戴朝六，等.參附注射液對肝缺血再灌注大鼠血漿前列環(huán)素和血栓素A2及肝組織ATP酶的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2007，5(4):427－431.

［4］王新良，王新穎，王佩薇等.一氧化氮在腎缺血再灌注損傷中的作用［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2006，22(11):2142－2145.

［5］Chao FC，David W，Chie PH，et a1.The protective effect of niacinamide on ischemia－reperfusion－induced liver injury［J］.Biomedical Sci，2004，8:446－452..

［6］韓英，劉楠，陳榮華，等.大鼠腦缺血再灌注損傷后的細(xì)胞凋亡與Bcl－2、Bax的表達(dá)［J］.中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2006，14(1):15～19.