陳 磊 吳高義 王昭領(lǐng) 朱國雄

下頜骨放射性骨壞死(Osteoradionecrosis of Mandible ORNM)是頭頸部惡性腫瘤放療后嚴(yán)重的并發(fā)癥，主要病理表現(xiàn)為放療后頜面部軟、硬組織處于低氧、少血管狀態(tài)，頜骨內(nèi)動(dòng)脈發(fā)生炎癥反應(yīng)，內(nèi)膜腫脹，骨髓及骨膜血管栓塞及纖維化，引起局部血供和營養(yǎng)障礙。現(xiàn)在觀點(diǎn)認(rèn)為ORNM是血管和Naversa骨系統(tǒng)放射后的晚期并發(fā)癥[1]。放療可導(dǎo)致組織血供變差、細(xì)胞活力下降、膠原蛋白減少。因此，如何促進(jìn)放療后骨組織內(nèi)血管的修復(fù)，對(duì)于治療ORNM具有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)[2]，低強(qiáng)度超聲波可以促進(jìn)血管的發(fā)生，改善局部血液循環(huán)，但運(yùn)用低強(qiáng)度超聲波治療ORNM，尚無相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究通過觀察低強(qiáng)度超聲對(duì)下頜骨內(nèi)微血管的作用，探討運(yùn)用低強(qiáng)度超聲波治療ORNM的可能機(jī)制。

1.材料與方法

1.1 材料 放射源采用Varian 600C/D電子加速器 (Varian Inc.Corporate， USA)； Leica DMLA全自動(dòng)顯微鏡(Leica公司，德國)，US10超聲治療儀(興萬電子儀器，香港)；健康成年雜種犬30只，雌雄不限，年齡2-3周齡，體重10-17kg，(由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，普通飼料喂養(yǎng)(山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 將犬隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)Ⅰ組、實(shí)驗(yàn)Ⅱ組和對(duì)照組，每組10只。2.5%戊巴比妥鈉30mg/kg犬小腿大隱靜脈注射麻醉。電子直線加速器行分次次照射。照射方法：總劑量60 Gy，分4次照射，每次15Gy，每2次之間間隔一周，對(duì)照組不行放射線照射。照射結(jié)束后1個(gè)月，無菌條件下拔除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙側(cè)下頜第一磨牙。繼續(xù)飼養(yǎng)動(dòng)物。

1.2.2 CD34免疫熒光染色 分別在放射線照射后1個(gè)月，2個(gè)月，4個(gè)月，3%戊巴比妥鈉30mg/kg行隱靜脈注射麻醉，取各實(shí)驗(yàn)組下頜骨磨牙區(qū)骨塊。4%多聚甲醛溶液固定2天，脫鈣，按常規(guī)組織免疫方法制成連續(xù)石蠟切片，片厚5μm，切片經(jīng)常規(guī)烤片，免疫組化SABC法抗CD34抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司北京)免疫熒光染色，二抗用熒光素標(biāo)記大鼠抗犬IgG(博奧森生物技術(shù)有限公司北京)，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察微血管的變化，光鏡下進(jìn)行觀察。熒光顯微鏡下CD34以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)呈棕紅色為陽性表達(dá)。

1.2.3 超聲治療和微血管密度(MVD)檢測(cè) 對(duì)放射線照射4個(gè)月后的實(shí)驗(yàn)Ⅰ組動(dòng)物行超聲治療，治療部位為雙側(cè)下頜第一磨牙區(qū)，方法為超聲強(qiáng)度30mW/cm2，頻率 1.5 MHz，脈沖寬度 200μs和重復(fù)頻率1kHz的脈沖波[3]，每天使用1次，每次20min，治療時(shí)間30d，實(shí)驗(yàn)Ⅱ組作為陰性對(duì)照不做超聲治療。

分別于超聲治療10d，20d，30d取材，下頜骨于20%多聚甲醛溶液固定2天。取部分脫鈣，石蠟包埋，按常規(guī)組織免疫方法制成連續(xù)石蠟切片，片厚5μm，切片經(jīng)常規(guī)烤片，免疫組化SABC法抗CD105(博奧森生物技術(shù)有限公司北京)抗體染色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光鏡下進(jìn)行觀察。CD105以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)呈棕褐色為陽性表達(dá)，對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行圖像采集，切片在40倍光鏡下挑選微血管分布最高區(qū)域，在200倍視野下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的被染成棕褐色的血管數(shù)目，取其平均值作為MVD，每一個(gè)與鄰近的微血管明顯分離的染成棕褐色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇都視為獨(dú)立的微血管并進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)間比較用成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)，有關(guān)指標(biāo)采用SPPS13.0統(tǒng)計(jì)軟件做相關(guān)分析。

2.結(jié)果

2.1 體表結(jié)果 在照射1周后，實(shí)驗(yàn)組犬均出現(xiàn)進(jìn)食困難、流口水、口腔內(nèi)粘膜潰爛等癥狀，1個(gè)月后，實(shí)驗(yàn)Ⅰ組、實(shí)驗(yàn)Ⅱ組犬的下頜開始脫毛，4個(gè)月后牙槽骨外露,主要位于拔牙區(qū)(圖1)。X線片上顯示局部骨小梁增粗，骨紋理模糊，出現(xiàn)不規(guī)則的結(jié)構(gòu)紊亂區(qū)，且密度不均勻

2.2 CD34免疫熒光結(jié)果 對(duì)照組CD34呈紅色熒光強(qiáng)陽性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)Ⅰ組呈陽性表達(dá)；實(shí)驗(yàn)Ⅱ組呈弱陽性表達(dá)(圖2-6)。

2.3 微血管密度(MVD)檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)Ⅰ組的微血管密度為：10d組(4.04±0.77)，20d組(6.22±0.65)，30d 組(7.13±0.43)；、實(shí)驗(yàn)Ⅱ組的微血管密度為(3.85±0.89)；對(duì)照組的微血管密度為(7.41±0.45)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示各組之間的差異具有顯著性的意義(P＜0.05)(表1)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)血管密度(n=5,)

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)血管密度(n=5,)

3.討論

3.1 建立下了頜骨放射性損傷的動(dòng)物模型 上世紀(jì)初，人們就已經(jīng)認(rèn)識(shí)到放射線能引起骨組織的損害，但通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來研究其損害是由Chambers等在1958年用狗開始的[4]。后來，不少學(xué)者相應(yīng)采用大鼠、兔、狗等動(dòng)物來做實(shí)驗(yàn)研究[5,6]。但由于鼠、兔類動(dòng)物體積小、生命力弱等原因一直未能建立理想的動(dòng)物模型。對(duì)于放療的劑量，普遍的觀點(diǎn)是，骨組織的放射耐受劑量為60Gy左右，當(dāng)放療超過60Gy時(shí)，骨修復(fù)損傷的能力受到較大損害。而整塊骨的大部分照射劑量小于60Gy時(shí)，骨組織尚處于其耐受劑量范圍，具有一定修復(fù)能力[7]。

因此，在本實(shí)驗(yàn)采用的總照射劑量為60Gy。放射線照射3個(gè)月后，我們通過X線片發(fā)現(xiàn)犬的下頜骨均出現(xiàn)骨小梁增粗，骨紋理模糊等ORNM的早期癥狀。在對(duì)血管內(nèi)皮標(biāo)記抗體CD34的檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長，犬下頜骨的CD34抗體陽性表達(dá)越來越弱，表明骨損傷的程度越來越嚴(yán)重，這也很好的模擬ORNM發(fā)生過程。說明直線加速器行多次照射總劑量60Gy完全可以作為犬ORNM模型的照射劑量。雖然更大的照射劑量雖然也可能發(fā)生ORNM，但有可能會(huì)引起動(dòng)物死亡，影響實(shí)驗(yàn)的繼續(xù)進(jìn)行。且60Gy已經(jīng)能夠較好模擬人的放療劑量。因此，我們認(rèn)為，本實(shí)驗(yàn)所采用的多次照射總劑量60Gy為犬ORNM動(dòng)物模型較為理想的照射劑量。

3.2 低強(qiáng)度超聲能夠促進(jìn)犬下頜骨微血管的生成 目前的血管內(nèi)皮標(biāo)記抗體主要有：CD34，CD31，CD105(endoglin)等，有人認(rèn)為CD34在微血管中表達(dá)最強(qiáng)，也有人認(rèn)為CD31對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞敏感性較強(qiáng)。但CD105(endoglin)對(duì)增殖狀態(tài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞有高度敏感性是大家所公認(rèn)的[8,9]，而其對(duì)于成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞卻無特異性，因而在目前還缺乏直接檢測(cè)血管豐富程度的情況下，可用CD105標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，檢測(cè)骨內(nèi)血管的增值程度已成為對(duì)血管生成定量分析的金指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用30mW/cm2強(qiáng)度的1MHz 1∶4脈沖超聲波作為實(shí)驗(yàn)組處理因素，超聲治療10d，20d，30 d，MVD逐漸增加，說明低強(qiáng)度超聲能夠促進(jìn)了骨組織的微血管生成，并可能以此促進(jìn)犬下頜骨血供。

3.3 低強(qiáng)度超聲促進(jìn)犬下頜骨微血管修復(fù)的機(jī)理 高能射線粒子對(duì)血管、骨等組織損傷，是通過細(xì)胞內(nèi)水分子轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂苫鏗+、OH+；與DNA、RNA或酶分子作用，破壞分解氨基酸或核酸序列。在細(xì)胞水平上，表現(xiàn)為染色體斷裂、交聯(lián)和分解，使細(xì)胞損傷或死亡。在組織水平上，則表現(xiàn)為血栓形成[10]，內(nèi)皮壞死和玻璃樣變性。因此，修復(fù)放射線損傷骨組織，促進(jìn)血液循環(huán)非常重要。

低強(qiáng)度超聲可以穿透組織，其產(chǎn)生的振蕩力作用于組織中包括細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的各種液體及胞膜成分。振蕩的生理效應(yīng)可以分為致熱效應(yīng)和非致熱效應(yīng)。致熱效應(yīng)能增加血運(yùn)，增加膠原延展性，減輕疼痛和肌肉痙攣[11]，超聲還能使無功能性毛細(xì)血供，從而使各類細(xì)胞因子及促進(jìn)骨愈合的必要成分的運(yùn)輸增強(qiáng)，促進(jìn)了營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝廢物排除[12]。

低強(qiáng)度超聲可以增加肥大細(xì)胞脫顆粒，增加白細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原，增加吞噬性成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)的釋放，實(shí)驗(yàn)表明超聲可以刺激人下頜骨細(xì)胞、牙齦成纖維細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生多種促進(jìn)血管發(fā)生的細(xì)胞因子，包括IL-8、bFGF和VEGF等[13]。進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成[14]，增加血流。超聲可以誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)(P-selectin and ICAM-1)，使移植入肌肉內(nèi)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)周圍血管發(fā)生[15]。

4.小結(jié)

低強(qiáng)度超聲對(duì)放射線損傷的下頜骨微血管修復(fù)作用更主要是通過促進(jìn)血管發(fā)生來間接促進(jìn)骨的愈合。超聲促進(jìn)創(chuàng)傷、慢性潰瘍愈合，促進(jìn)骨折等作用都與其增強(qiáng)血管生成的作用密切相關(guān)。最佳時(shí)機(jī)多在固定期早期。但究竟低強(qiáng)度超聲具體作用的靶細(xì)胞是什么，其作用的詳細(xì)機(jī)制以及信號(hào)傳導(dǎo)途徑還有待進(jìn)一步闡明。

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