閆文娟 楊德鴻 吳補領(lǐng)

牙菌斑生物膜是齲病的始動因子,變形鏈球菌是公認(rèn)的主要致齲菌，變形鏈球菌在牙齒表面黏附、聚集并形成菌斑生物膜是其致齲的關(guān)鍵因素。環(huán)鳥苷二磷酸(3',5'-Cyclic diguanylic acid;c-di-GMP)是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌第二信使，它的作用涉及生物膜形成、毒力因子的表達(dá)等多個方面，是細(xì)菌生存和代謝的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子之一[1,2]。在前期的研究中我們證實變形鏈球菌內(nèi)部存在c-di-GMP信號通路，可影響變形鏈球菌的生物膜形成和在牙齒表面的黏附等，但其作用機制未明，基因重組技術(shù)為變形鏈球菌致齲毒力基因功能的研究提供了一個有力的工具[3]。本研究擬構(gòu)建變形鏈球菌中c-di-GMP相關(guān)蛋白基因gcp(AEO14133)基因突變株，為下一步的變形鏈球菌c-di-GMP功能及多種防齲機制的研究奠定基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 S.mutans UA159(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院)；E.coli Top 10、pMD-19T質(zhì)粒(大連寶生物工程有限公司)；PVA8912自殺載體(College of Newcastle，England)，全長約 2.9 kb，含有多克隆位點。

1.2 主要試劑 LA Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶(大連寶生物工程有限公司)；凝膠回收試劑盒(Clontech公司)；質(zhì)粒小量提取試劑盒(Omega公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker(北京天為時代公司)；LB培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基(Oxoid，England，CM225)，氨芐青霉素(Amp)濃度100mg/mL，紅霉素分別為 400-500 mg/L(E.coli)和 20 mg/L(S.mutans)。

1.3 變形鏈球菌UA159的DNA提取 用磷酸鹽緩沖液(PBS)復(fù)蘇變形鏈球菌UA159凍干粉，于BHI培養(yǎng)基劃線復(fù)蘇培養(yǎng)，經(jīng)革蘭氏染色和生化鑒定后，在厭氧箱內(nèi)(N2：85%、CO2：5%、H2：10%)37℃厭氧培養(yǎng)48h，挑取單克隆接種于新鮮配制的BHI培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24h，取3ml菌液，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明提取DNA，凝膠電泳鑒定后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增gcp基因內(nèi)部片段 通過Genebank查詢gcp基因(ID：AEO14133)上下游同源堿基序列，設(shè)計一對PCR引物，上游引物為：5’-TTACGCATGCATGATTTTGTTTGGAATT TTGGC-3’(下劃線代表Sph I酶切位點)，下游引物為：5’-TAGCGAATTCTTTCACGGATAACA GCTTGGTC-3’(下劃線代表EcoR I酶切位點)。以細(xì)菌DNA片段為模板，配制50μl的反應(yīng)體系，通過PCR擴增873bp內(nèi)部序列，對應(yīng)于Gcp蛋白的19-310氨基酸序列。PCR擴增結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，并用DNA凝膠回收試劑盒純化回收。

1.5 PCR產(chǎn)物的重組及克隆 將純化后的PCR擴增產(chǎn)物和pMD-19T載體連接，16℃孵育16h；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化細(xì)菌涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆接種于含Amp的LB培養(yǎng)液中37℃振搖過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用SphI/EcoRI酶切鑒定。鑒定正確的克隆命名為pMD-gcp。

1.6 打靶載體pVA8912-gcp的構(gòu)建及鑒定將pVA8912質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞中，進行擴增，用質(zhì)粒小量提取試劑盒純化獲得的質(zhì)粒DNA以及pMD-gcp質(zhì)粒，用SphI/EcoRI雙酶切，DNA凝膠電泳檢測并切膠純化。取gcp內(nèi)部序列片段和線性化pVA8912片段按照摩爾比3∶1的比例，用T4 DNA連接酶于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞后，在含紅霉素的LB培養(yǎng)板上篩選陽性克隆，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，獲得pVA8912-gcp。

1.7 變形鏈球菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 挑取變形鏈球菌UA159單克隆接種于BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h，取100 μL變形鏈球菌液接種入5mL的BHIS(含5%馬血清)，37℃厭氧培養(yǎng)18h。從上述菌液中取出100ul加入到37℃預(yù)熱的BHIS中，培養(yǎng)3h，加入10μg/mL的pVA8912-gcp質(zhì)粒，輕輕晃動后37℃孵育30min，加入1ml 37℃預(yù)熱的BHIS繼續(xù)孵育90 min，涂布于含紅霉素的BHI平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h。

1.8 變形鏈球菌UA159gcp基因突變菌株的篩選及鑒定 選取位于BHI抗性平板上的陽性克隆菌落數(shù)個，分別接種于含紅霉素的BHI液體培養(yǎng)基中，經(jīng)鑒定證實為變形鏈球菌。提取突變菌株基因組DNA，采用PCR法進行突變菌株的鑒定。依據(jù)變形鏈球菌UA159 gcp序列設(shè)計引物，擴增包含gcp基因上游119bp的片段，引物序列如下(5’-3’)：P1：5’-TCTATCTTGAAGGAAAGAATAGAAGTC-3’；P2：5’-GCGACTCCGTGCAGATATACAA AC-3’。利用引物P1和P2自變形鏈球菌UA159 gcp功能喪失菌株中擴增目的片段，PCR產(chǎn)物回收后用PstI酶切擴增片段，電泳觀察。

2.結(jié)果

2.1 gcp基因內(nèi)部片段的克隆 通過PCR擴增得到gcp基因編碼區(qū)(57 bp-930 bp)的內(nèi)部序列，全長為873 bp，連接pMD-19T載體后，經(jīng)SphI/EcoRI酶切鑒定結(jié)果見圖1。通過以上鑒定初步可以認(rèn)為gcp基因，經(jīng)過序列測定，結(jié)果正確。

2.2 打靶載體pVA8912-gcp的鑒定 自殺載體pVA8912來源于質(zhì)粒pVA891，帶有紅霉素抗性基因，能夠在大腸桿菌中復(fù)制，但不能在鏈球菌中復(fù)制。采用SphI/EcoRI雙酶切自pMD-gcp質(zhì)粒中切出包含gcp基因內(nèi)部序列的片段，定向插入同樣酶切的自殺載體pVA8912中，構(gòu)建gcp基因打靶載體pVA8912-gcp，873bp的gcp基因內(nèi)部片段克隆入SphI/EcoRI雙酶切后的pVA8912質(zhì)粒中，構(gòu)建gcp基因打靶載體pVA8912-gcp。轉(zhuǎn)化S.mutans后，載體骨架通過同源重組插入S.mutans基因組中g(shù)cp基因內(nèi)部，使gcp基因失活，酶切鑒定結(jié)果見圖2。

2.3 gcp基因失活突變菌株的鑒定 以變形鏈球菌UA159基因組DNA為模板擴增出1913bp片段，而以gcp突變菌株基因組DNA為模板擴增得到5742 bp片段，電泳結(jié)果如圖3a所示，與預(yù)期結(jié)果相符，證實了突變菌株中的gcp基因被成功替代。為排除PCR結(jié)果假陽性的可能，將PCR產(chǎn)物回收，用PstI單酶切，電泳結(jié)果顯示，突變型菌的PCR產(chǎn)物可以切出四條帶，比野生型菌多出一條約3.8 kb的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖3b)。

3.討論

基因缺失是目前研究基因功能最常用的技術(shù)之一，該技術(shù)將外源性DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀，這一過程需要質(zhì)粒來介導(dǎo)供體DNA。自殺質(zhì)粒應(yīng)具備以下條件：①自殺質(zhì)粒在受體菌中不能復(fù)制；②自殺質(zhì)粒必須帶有一個在整合到染色體內(nèi)以后可供選擇的抗性標(biāo)記；③自殺質(zhì)粒帶有易于克隆的多克隆位點。在變形鏈球菌的研究中最常用的自殺質(zhì)粒是R質(zhì)粒的衍生質(zhì)粒。該質(zhì)粒在進行復(fù)制時需要一種特殊的蛋白質(zhì)，但是大多數(shù)細(xì)菌不產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)。因此，當(dāng)自殺質(zhì)粒進入受體菌時，只有整合到受體菌染色體中才能進行復(fù)制。在基因功能研究中根據(jù)自殺質(zhì)粒的特點，將目的基因片斷克隆入自殺質(zhì)粒中，利用同源重組原理[4]，定位自殺質(zhì)粒的整合位點，構(gòu)建特定基因缺失的菌株，從而研究該基因的功能[5]。本實驗為深入研究gcp基因與變形鏈球菌致齲性之間的關(guān)系，需利用同源重組原理構(gòu)建gcp基因功能喪失菌株[6]，因此本實驗工作的重要內(nèi)容之一就是構(gòu)建符合同源重組條件的合格質(zhì)粒載體。

本實驗中所采用的自殺載體pVA8912是鏈球菌自殺載體之一，含有紅霉素抗性基因和多克隆位點，可以作為篩選標(biāo)志[7]。同時自殺載體pVA8912只具有E.coli的復(fù)制起始區(qū)序列但是缺乏鏈球菌的復(fù)制起始區(qū)序列，因此能夠在E.coli中復(fù)制而不能夠在鏈球菌中復(fù)制。在轉(zhuǎn)化鏈球菌后，可以通過單次交換同源重組的方式整合到細(xì)菌基因組中。這種轉(zhuǎn)化的效率要比采用線性DNA轉(zhuǎn)化的二次交換同源重組的效率高104倍左右[8]。同時，實驗中還應(yīng)用同源基因DNA片段構(gòu)建載體，提高了同源重組的發(fā)生頻率[9]。利用自殺載體轉(zhuǎn)換鏈球菌時需要選擇同源序列的長度和位置。如果同源序列過短，可能會造成同源重組的機率過低，而較難獲得中靶克隆基因；如果同源序列過長，又可能會造成打靶載體過大，操作不方便。同時，同源重組后會產(chǎn)生兩個不完整的gcp結(jié)構(gòu)基因構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)序列，如果同源序列過長，外源基因插入后的gcp基因仍可能會有截短了的功能區(qū)蛋白表達(dá)，從而不能完全失活該基因。

本實驗中同源DNA臂的長度在0.35 kb到2.15 kb之間時，隨著DNA同源片段長度的增加，同源重組頻率呈指數(shù)增加[10，11]。轉(zhuǎn)化完成后，形態(tài)學(xué)觀察及生化檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌株形態(tài)及生化特性與變形鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基本一致。以轉(zhuǎn)化菌株的基因組DNA為模版進行PCR，結(jié)果顯示這一區(qū)域的片段長度由原來的約2.5kb增加至約6.2kb，說明gcp基因內(nèi)插入了其它的DNA片段。對PCR產(chǎn)物進行進一步酶切分析，得到的酶切片段的大小和數(shù)量均與預(yù)期相符，從核酸水平上證明了打靶載體成功的插入到gcp基因中，為進一步的gcp功能研究提供了有價值的細(xì)菌模型。

本實驗根據(jù)同源重組原理，利用自殺載體PVA8912成功構(gòu)建了gcp基因失活菌株，為以后研究gcp基因在變形鏈球菌中的致齲機制及功能奠定基礎(chǔ)。

[1]SchirmerT and JenalU.Structuraland mechanistic determinants of c-di-GMP signaling[J].Nat Rev Microbiol,2009,7(10)：724-735

[2]Jonas K,Melefors O,and Romling U.Regulation of c-di-GMP metabolism in biofilms[J].Future Microbiol,2009,4：341-358

[3]Yan W,Qu T,Zhao H et al.The effect of c-di-GMP(3'-5'-cyclic diguanylic acid)on the biofilm formation and adherence of Streptococcus mutans[J].Microbiol Res,2010,165(2)：87-96

[4]段 勁,劉筱娣,郭麗宏.變形鏈球菌UA159磷酸蔗糖變位酶基因功能喪失菌株的構(gòu)建 [J].實用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2008,24(1)：69-73

[5]TaoL,LeBlancDJ,FerrettiJJ.Novelstreptococcal-integration shuttle ectors for gene cloning and inactivation [J].Gene,1992,120(1)：105-110

[6]Merritt J,Tsang P,Zheng L et al.Construction of a counterselection-based in-frame deletion system for genetic studies of Streptococcus mutans[J].Oral Microbiol Immunol,2007,22(2)：95-102

[7]Xie Z,Okinaga T,Qi F,et al.Cloning-independent and counterselectable markerless mutagenesis system in Streptococcus mutans[J].Appl Environ Microbiol,2011,77(22)：8025-8033

[8]Tao L.Streptococcal integration vectors for gene inactivation and cloning[J].Methods Cell Sci,1998,20：59-64

[9]Bennett PM.Plasmid encoded antibiotic resistance：acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in bacteria[J].Br J Pharmacol,2008,153(1)：S347-357

[10]Indranil Biswas, Alexandra Gruss, Dusko Ehrlich.High-efficiency gene inactivation and replacement system for gram-positive bacteria [J].Journel of bacteriology,1993,175(11)：3628-3635

[11]Rong R,Slupska MM,Chiang JH et al.Engineering large fragment insertions into the chromosome of Escherichia coli[J].Gene,2004,336(1)：73-80