劉憲軍吉林省吉林市中心醫(yī)院病理科，吉林吉林　132011

超聲波在骨組織及骨髓活檢中的應(yīng)用

劉憲軍
吉林省吉林市中心醫(yī)院病理科，吉林吉林132011

目的觀察超聲波在骨組織及骨髓活檢中的應(yīng)用效果。 方法采用超聲波作用下稀硝酸水浴加熱后脫鈣。結(jié)果脫鈣充分，快速，保存了骨組織細(xì)胞病變的基本結(jié)構(gòu)，時(shí)間短，效果好，可以進(jìn)行連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，利于對骨疾病及骨髓病變的正確診斷。結(jié)論此種脫鈣方法適宜標(biāo)本量不大的基層醫(yī)院推廣使用，方法簡單，容易掌握，解決了骨組織病理制片難題。

超聲波；骨及骨髓活檢；脫鈣；切片

［Abstract］Objective To observe the app1ication effect of u1trasound in bone and bone marroe biopsy.Methods The samp1es were heated in di1ute nitric acid water bath and deca1cified under u1trasound.Results Deca1cification was fu11y comp1eted in a short time with favorab1e effect，and the basic structure of 1esion of bone ce11s was preserved.The samp1es were used for seria1 section and immunohistochemistry，which cou1d faci1itate correct diagnosis of bone and bone marrow 1esions.Conclusion This method for deca1cification can be promoted in primary hospita1s with sma11 samp1e size，because it is easy to 1earn and operate and so1ve the prob1em of making bone patho1ogica1 s1ide.

［Key words］U1trasound；Bone and bone marrow biopsy；Deca1cification；Section

骨組織是一種極堅(jiān)硬的結(jié)締組織，其主要成分是黏多糖、骨膠纖維及大量的無機(jī)鈣鹽羥基磷灰石晶體，其存在形式多為水合磷酸鈣鹽及少量碳酸鈣鹽［1］，在石蠟制片時(shí)無法切片，骨組織的生物學(xué)特性決定了制作骨組織病理切片時(shí)只有除去鈣鹽，使骨組織軟化，并且保證骨組織病變的基本形態(tài)，才能進(jìn)行病理石蠟制片［2］。實(shí)際工作中經(jīng)常遇到因脫鈣不充分或脫鈣過度無法正常進(jìn)行組織制片，我科室采用超聲波作用下稀硝酸水浴加熱，進(jìn)行脫鈣處理，取得了較好的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本組織采集

標(biāo)本采用我院2015年5～8月試驗(yàn)骨組織及骨髓活檢組織。標(biāo)本分為三組，第一組為骨肉瘤脫鈣的骨組織10例；第二組為骨髓活檢組織5例；第三組為骨肉瘤骨組織及骨髓活檢組織各2例。

1.2試劑

脫鈣劑（酸性較低的常規(guī)脫鈣劑）為5%硝酸水溶液（硝酸5 mL，蒸餾水95 mL）；固定液為40%甲醛50 mL，甲醇100 mL，蒸餾水200 mL。

1.3方法

由于骨組織質(zhì)地致密堅(jiān)硬，并且含有骨膠等不易溶于水的有機(jī)成分，所以對骨組織的固定、脫水透明浸蠟都比較困難［3］，無論是蘇木素伊紅染色，還是特殊染色，免疫組織化學(xué)染色都必須將骨組織及時(shí)充分固定，只有將骨組織固定好，才能保存好骨組織的生物學(xué)結(jié)構(gòu)特征，避免骨組織自溶，阻止細(xì)胞內(nèi)分解酶的活性，防止丟失某些特殊的抗原。骨組織的固定基本上有先固定后脫鈣，或者固定脫鈣同時(shí)進(jìn)行，或者先脫鈣后固定［4］，但是多數(shù)科室都采用先固定后脫鈣的方法。將骨組織鋸成小方塊，厚度不超過3 mm，骨髓組織按穿刺標(biāo)本待用，用蒸餾水將40%的甲醛溶液配制成10%溶液，然后用它將甲醇配制成70%的小AF液（甲醇活性比乙醇強(qiáng)），將各組織取完材超聲波充分水浴固定約30 min后水洗。然后打開超聲快速組織處理儀，水溫調(diào)到70℃，分兩組燒杯各加入10%的稀硝酸溶液分別置于不同的超聲磁頭上水浴加熱，并開始計(jì)時(shí)，20 min骨髓活檢組織完成脫鈣程序，60 min后可以使用大頭針刺穿法觀察骨肉瘤組織的脫鈣程度，另一組混合骨組織常規(guī)操作，放在室溫下觀察。最后將上述完成脫鈣的骨肉瘤組織及骨髓活檢組織浸入自來水中10 min，完成脫鈣步驟，然后進(jìn)行常規(guī)石蠟的制片程序。

2　結(jié)果

2.1標(biāo)本處理后結(jié)果

第一、第二兩組骨組織由于5%的稀硝酸相對于以前使用的10%的稀硝酸酸性弱，且是在超聲波作用下水浴加熱，加速了骨組織鈣離子與稀硝酸溶液的交換，脫鈣充分，降低了硝酸對骨膠纖維及骨細(xì)胞骨架的破壞，保存了骨組織細(xì)胞病變的基本結(jié)構(gòu)［5］，由于此種方法脫鈣溫柔，脫鈣徹底，對骨髓組織破壞小、時(shí)間短、效果好，可以連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，利于對骨疾病及骨髓病變的正確診斷。尤其是對白血病等血液方面的疾病診斷更有比塑料包埋無法比擬的優(yōu)勢［6］，如上述的可連續(xù)切片、對組織破壞小等。第三組24 h后才進(jìn)行常規(guī)石蠟制片程序。但是由于脫鈣時(shí)間過長，導(dǎo)致硝酸大量殘留，而使骨組織呈黃色，需要流水30 min的沖洗。見圖1、2。

圖1　平滑肌肉瘤脫鈣實(shí)驗(yàn)制片效果（顯微鏡HE×4O染色）

圖2　慢性粒細(xì)胞白血病急變實(shí)驗(yàn)脫鈣效果（顯微鏡HE×4O染色）

2.2載玻片要求

所有含骨組織制片過程中，切片是重點(diǎn)，防止脫片也很關(guān)鍵。由于含有骨組織的蠟塊骨組織硬，切片容易起毛毛刺，厚度不均，粘附力差，這是骨組織脫片的主要原因［7］。因此對于骨組織的載玻片要求潔凈，透光度好，可以使用免疫組化的防脫載玻片。烤片溫度應(yīng)設(shè)置在80℃，貼附烘烤15 min，可以加速石蠟融化，充分從組織內(nèi)融出，最大限度地降低烤片不徹底對下一步的影響。

2.3染色要求

如果骨組織脫鈣充分，就沒有膨脹現(xiàn)象；切片完整，無刀痕、破碎情況。蘇木素伊紅染色，應(yīng)該加溫，滴液染色，防止染色時(shí)掉片，示細(xì)胞核藍(lán)色、胞漿紅色，細(xì)胞輪廓清晰，色澤鮮艷，對比度強(qiáng)［8］。在骨組織的蘇木素伊紅染色過程中，每個(gè)制片步驟都應(yīng)該加溫進(jìn)行，可以縮短全部過程的時(shí)間，也可以增強(qiáng)染色的效果。染色的溫度控制在45℃水浴加熱即可。免疫組化染色著色感強(qiáng)，易于抗原修復(fù)，抗原修復(fù)時(shí)溫度不宜太高［9］，甚至可以脫完石蠟后直接進(jìn)行免疫組化染色，以防掉片造成標(biāo)本余量少而無法診斷。

2.4封片要求

無論脫鈣的骨組織處理的如何理想，都不能像軟組織一樣粘附在載玻片上，因此需要封片樹膠濃度大一點(diǎn)，免得二甲苯揮發(fā)后產(chǎn)生空殼切片，無法重新封片。

3　討論

骨組織是一種有別于一般的軟組織的極堅(jiān)硬的結(jié)締組織，其主要成分是黏多糖、骨膠纖維及大量的無機(jī)鈣鹽羥基磷灰石晶體，按照人體生理結(jié)構(gòu)組成而特別堅(jiān)硬［10］。骨組織的生物學(xué)特性，骨組織的生物學(xué)結(jié)構(gòu)主要由骨細(xì)胞及骨基質(zhì)構(gòu)成，骨基質(zhì)主要由膠原纖維、黏蛋白、無機(jī)羥基磷酸鹽、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶等各種有機(jī)物質(zhì)及無機(jī)物質(zhì)緊密連接而成，不同部位的骨組織由于其承受的功能不同其形態(tài)及活躍狀態(tài)也不同，有的呈梭形、多邊形、橢圓形及卵圓形等，因此對不同部位不同病變應(yīng)該使用不同條件的脫鈣方法［11］。骨組織雖然堅(jiān)硬但是又具有生命活性，其存在形式多為水合磷酸鈣鹽及少量碳酸鈣鹽［12］，在石蠟制片時(shí)無法切片，骨組織的生物學(xué)特性決定了制作骨組織病理切片時(shí)只有除去鈣鹽，使骨組織軟化，并且保證骨組織病變的基本形態(tài)，才能進(jìn)行病理石蠟制片。實(shí)際工作中經(jīng)常遇到因脫鈣不充分或脫鈣過度無法正常組織制片，就會出現(xiàn)組織過硬無法切片，造成切片撕裂、蹦丟組織、損壞刀片或骨組織形成骨泥失去了骨組織的病變特征，不能完整制成切片或失去了制片的目的。從各種文獻(xiàn)報(bào)道對骨組織的脫鈣處理方法很多，常用的有稀硝酸、混合酸、離子交換、電泳脫鈣、微波技術(shù)脫鈣等都有其存在的必要，在骨組織脫鈣環(huán)節(jié)上均進(jìn)行了深入探索，極大地改善了骨組織的切片質(zhì)量，提高了骨組織蘇木素伊紅的生物學(xué)染色效果，同時(shí)在免疫組織化學(xué)、腫瘤熒光原位雜交等技術(shù)方面也有進(jìn)一步的嘗試［13］。

脫鈣是各種骨組織常規(guī)制片過程的關(guān)鍵技術(shù)，對于甲狀腺的鈣化組織或骨組織常規(guī)制片都困難較大，特別是肋骨、頜骨、顱骨較硬的骨組織制片難度更大［14］。因此，要切出一張優(yōu)質(zhì)骨組織石蠟切片，前提是將骨組織進(jìn)行充分固定，以保持骨組織細(xì)胞基本病變狀態(tài)；然后選擇一種對組織細(xì)胞破壞程度弱、適合常規(guī)染色及免疫組化染色的脫鈣劑。以前工作中常選用10%硝酸水溶液，相對酸性強(qiáng)，促進(jìn)離子交換單一，脫鈣時(shí)間長，不易掌握，一般可達(dá)5～48 h，縮短脫鈣時(shí)間有利于減少硝酸在骨組織內(nèi)的殘留，并且能完整保留骨組織及骨髓組織內(nèi)的病變結(jié)構(gòu)及組織成分，特別是對于骨組織惡性腫瘤及造血系統(tǒng)骨髓活檢的免疫組織化學(xué)染色檢查與診斷具有特殊意義。免疫組織化學(xué)染色是骨組織惡性腫瘤診斷必不可少的檢查方法［15］，大大縮短了對骨組織疾病的診斷時(shí)間，提高了骨組織常規(guī)制片的效率。圖1、圖2所示骨小梁結(jié)構(gòu)清晰，保留了骨組織的完整結(jié)構(gòu)，HE染色細(xì)胞核，細(xì)胞仁著色力強(qiáng)，染色層次分明，切片薄厚均勻，無刀痕［16］。

綜合上述實(shí)際工作中的應(yīng)用，此方法制成的骨組織的片子組織結(jié)構(gòu)清晰，不易斷裂，結(jié)構(gòu)完整，無刀痕，降低了骨性組織制片時(shí)間，達(dá)到了病理制片的基本要求，片子染色清晰，鮮明，利于診斷。此種脫鈣方法適宜標(biāo)本量不大的基層醫(yī)院推廣使用，方法簡單，容易掌握，解決了骨組織病理制片難題。

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APPlication of ultrasound in bone and bone marrow bioPsy

LIU Xianjun
Department of Patho1ogy，Ji1in Centra1 Hospita1 in Ji1in Province，Ji1in 132011，China

R738.1

B

1673-97O1（2O16）11-O11O-O3

2016-02-17）