【摘要】骨組織鈣化沉積，含有大量膠原纖維，較難提取出純凈的RNA。通過實(shí)驗(yàn)條件摸索在傳統(tǒng)的Trizol法進(jìn)行改進(jìn)，利用電動研磨棒研磨小鼠骨組織，再用Trizol和水飽和酚2：1裂解，加大離心轉(zhuǎn)速，氯仿提純后上清液與異丙醇、鈉鹽的比例為1：0.75：0.2混合提純。用此方法得到的RNA濃度、純度均高于對照組，完整性良好，可以用于后期小鼠骨組織分子生物學(xué)研究。

【關(guān)鍵詞】小鼠;骨組織;RNA

【中圖分類號】R580? ? ? ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2020.14.293

研究疾病相關(guān)的靶點(diǎn)和作用機(jī)制常用分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，其中RT-PCR（reverse transcription-PCR）逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)被廣泛應(yīng)用。RT-PCR技術(shù)是將RNA鏈逆轉(zhuǎn)錄成為CDNA，再以此為模板通過PCR技術(shù)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，以此實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)和基因定量分析的目的[1]。提取純凈的RNA 是RT-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)前提。目前大部分的組織樣本均可采用經(jīng)典Trizol法提取RNA，效果較好。

而骨組織鈣化、硬度大，裂解過程困難，即使裂解成功，骨組織內(nèi)鈣鹽沉積、骨細(xì)胞密度低，膠原纖維雜質(zhì)多等問題導(dǎo)致較難得到高質(zhì)量的RNA[2]。對于提骨RNA的實(shí)驗(yàn)方法一直在探索過程中，本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)的Trizol法上進(jìn)行改良研究，摸索出有效提取骨組織中RNA的方法，有利于推動骨相關(guān)疾病的機(jī)制研究。

1? 材料和方法

1.1主要試劑和儀器

TRIzol提取液（Invitrogen公司），1 %非變性瓊脂糖凝膠，75%乙醇、氯仿、異戊醇、水飽和酚、DEPC水、鈉鹽。低溫離心機(jī)（Thermo公司），醫(yī)用超凈工作臺（SW-CI-IFD公司），NANODrop2000c（Thermo公司），膠成像分析系統(tǒng) （Bio-Rad公司）。

1.2組織來源

健康昆明種小白鼠6只，雄性，4周齡，體重20 - 30 g。采用脫頸法處死，迅速解剖剝離雙側(cè)脛骨組織，用生理鹽水沖洗干凈，放于液氮中保存。

1.3骨RNA提取

第一組（對照組）：隨機(jī)稱取25 g的骨組織3份，在標(biāo)準(zhǔn)條件下用傳統(tǒng)Trizol法一步裂解，氯仿純化、異丙醇沉淀、乙醇再純化，干燥后得到3份RNA沉淀，每份加入10μL DEPC水溶解。

第二組（改良組）：隨機(jī)稱取25 g的骨組織3份放入2mlEP管中，每份加入300 μL的TRIzol浸泡5 min后，加入150 μL水飽和酚電動研磨成組織勻漿;每管補(bǔ)加700 μL的TRIzol和300 μL水飽和酚，渦旋充分混合，靜置10 min后分三層;吸取上清液轉(zhuǎn)入含有濾膜的2 mLEP管中，4℃離心13500轉(zhuǎn)15 min;取上清液，加入500 μL氯仿，再次重復(fù)渦旋靜置離心;取上清液按1∶0.75∶0.25的比例加入異丙醇和鈉鹽，同上渦旋靜置離心;棄上清，沉淀加入75 %的乙醇800 μL，同上渦旋靜置離心;棄上清，沉淀加入10 μL的1 ‰DEPC水溶解。

1.4 RNA樣品濃度、純度及完整性檢測

兩組RNA 樣品分別用NANODrop2000c型紫外分光光度計(jì)測定核酸的濃度C （μg/ml），和 純度（A260 / A280值）。用1 %非變性瓊脂糖凝膠，在電壓110V，30min 電泳，觀察 RNA 的 28S、18S條帶是否清晰，判斷 RNA的完整性及有無 DNA污染。

2? 結(jié)果

2.1 RNA濃度

在提取過程中肉眼可見對照組提取的RNA有明顯白色塊狀物，加入DEPC水后不能溶解，而改良組提取的RNA呈白色絮狀，能輕易被DEPC溶解。對照組和改良組提取的RNA 經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測的濃度如圖1，改良組的濃度值明顯高于對照組（P<;0.05）。

2.2 RNA純度

對照組和改良組提取的RNA 經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測的純度如圖2，改良組的純度值明顯高于對照組（P<0.05）。對照組的純度均低于1.85，改良組的RNA純度均高于1.85。

2.3 RNA完整性

兩組的總 RNA經(jīng)EB染色，1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察到對照組條帶成團(tuán)高亮，彌散明顯，疑為蛋白多糖類或 DNA小片段污染。改良組在28s，18s有清晰條帶，無彌散出現(xiàn)，并且28S處條帶明顯比18S條帶亮。證明改良組的RNA是完整的。

3? 討論

在傳統(tǒng)的Trizol法提取骨RNA的過程中，發(fā)現(xiàn)RNA有白色沉淀不溶于DEPC水，測得濃度和純度均不佳。經(jīng)過文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)骨組織中RNA 較難提取的原因主要是，硬度大、裂解困難以及膠原纖維等雜質(zhì)多。在本實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)對照組的瓊脂糖凝膠實(shí)驗(yàn)抱團(tuán)彌散，證明RNA可能被膠原纖維蛋白多糖污染。針對以上問題，考慮在傳統(tǒng)方法中加入電動研磨棒進(jìn)行研磨，水飽和酚、鈉鹽提純分離膠原纖維等雜質(zhì)，水飽和酚能分離骨組織中的蛋白多糖，鈉鹽能另蛋白多糖溶解[3]已有部分研究提出相關(guān)思路。

但不同組織的提取方法略有差異，通過多次實(shí)驗(yàn)條件摸索，最終得到將Trizol和水飽和酚2：1裂解，加大離心轉(zhuǎn)速，氯仿提純后上清液與異丙醇、鈉鹽的比例為1：0.75：0.2混合提純。在此實(shí)驗(yàn)條件下得到的小鼠脛骨RNA濃度純度均佳，可以用于后續(xù)RT-PCR技術(shù)研究。

參考文獻(xiàn)：

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作者簡介：

張榮浩（1995-），女，醫(yī)學(xué)碩士，重慶化工職業(yè)學(xué)院專任教師，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)。