朱淑玲++武彤彤++吳惠如等

【摘要】 目的 分析不同脫鈣條件對(duì)骨組織免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色抗原性的影響。方法 用8%硝酸分別于微波、光波及光波+微波組合Ⅰ、光波+微波組合Ⅱ的條件下對(duì)骨組織進(jìn)行脫鈣， 并將室溫（20℃）條件下脫鈣的骨組織作為對(duì)照組， 運(yùn)用鏈霉菌素卵白素-生物素（LSAB）免疫組化染色技術(shù)， 并對(duì)其染色效果進(jìn)行分析比較。結(jié)果 微波、光波、光波+微波組合Ⅰ及光波+微波組合Ⅱ的脫鈣時(shí)間顯著低于對(duì)照組， 且免疫組化染色效果顯著優(yōu)于對(duì)照組（P<0.05）；光波+微波組合的免疫組化染色效果顯著優(yōu)于微波、光波（P<0.05）；但微波與光波之間、光波+微波組合Ⅰ與光波+微波組合Ⅱ之間的免疫組化染色效果比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 光波+微波組合脫鈣時(shí)間要明顯短于微波、光波及室溫脫鈣， 且具有良好的免疫組化染色效果。

【關(guān)鍵詞】 脫鈣條件；骨組織；免疫組織化學(xué)染色；抗原性

【Abstract】 Objective To analyze influence by different decalcification conditions on bone tissue antigenicity in immunohistochemical staining. Methods Decalcification was made through 8% nitric acid under microwave， light wave， light wave + microwave Ⅰ and light wave + microwave Ⅱ in bone tissue. Decalcification under room temperature （20℃） was taken as control group. Labelled streptavidin biotin method （LSAB） immunohistochemical staining was applied to analyze and compare stain effects. Results Decalcification time under microwave， light wave， light wave + microwave Ⅰ and light wave + microwave Ⅱ were all shorter than control group， and their immunohistochemical staining effects were all better than control group （P<0.05）. Light wave + microwave had better immunohistochemical staining effects than single microwave or light wave （P<0.05）. There was no statistically significant difference of immunohistochemical staining effects across microwave， light wave， light wave + microwave Ⅰ and light wave + microwave Ⅱ （P>0.05）. Conclusion Light wave + microwave provides shorter decalcification time than microwave， light wave and room temperature， and it contains good immunohistochemical staining effect.

【Key words】 Decalcification condition； Bone tissue； Immunohistochemical staining； Antigenicity

目前， 免疫組化染色技術(shù)是臨床病理鑒別及診斷的重要手段， 骨組織由于含有豐富的鈣鹽， 因此其免疫組織化學(xué)染色自然與常規(guī)石蠟切片有所區(qū)別， 通常需要先去除鈣鹽后才可制成比較薄的切片， 然后再進(jìn)行常規(guī)脫水、透明處理等操作[1]。本研究旨在分析探討不同脫鈣條件對(duì)骨組織免疫組化染色抗原性的影響， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取2012年4月～2015年8月骨外科送檢的人骨組織， 脫鈣液為硝酸10 ml+蒸餾水190 ml制成的硝酸液。Panasonic NN-DF382M光波/微波爐1臺(tái)， 微波額定輸入功率為1400 W， 光波額定輸入功率為1050 W， 微波額定輸出功率為900 W， 額定輸出頻率為2450 MHz， 輸出功能共分為微波、光波及光波+微波組合Ⅰ、光波+微波組合Ⅱ。微波輸出功率為5個(gè)調(diào)節(jié)檔， 光波輸出功率為單一光波管發(fā)光， 光波+微波組合Ⅰ為微波輸出時(shí)間的30%+光波輸出時(shí)間的70%， 光波+微波組合Ⅱ?yàn)槲⒉ㄝ敵鰰r(shí)間的55%+光波輸出時(shí)間的45%。

1. 2 方法 將1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm的骨組織分別用8%硝酸分別于微波、光波及光波+微波組合Ⅰ、光波+微波組合Ⅱ的條件下進(jìn)行脫鈣。將脫鈣后的骨組織常規(guī)制成切片， 經(jīng)復(fù)合酶消化石蠟切片后， 運(yùn)用LSAB免疫組化進(jìn)行免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

微波、光波、光波+微波組合Ⅰ及光波+微波組合Ⅱ的脫鈣時(shí)間顯著低于對(duì)照組， 且免疫組化染色效果顯著優(yōu)于對(duì)照組（P<0.05）；光波+微波組合的免疫組化染色效果顯著優(yōu)于微波、光波（P<0.05）；但微波與光波之間、光波+微波組合Ⅰ與光波+微波組合Ⅱ之間的免疫組化染色效果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

骨組織含有大量的鈣， 質(zhì)地堅(jiān)硬， 一般不可直接進(jìn)行制片染色， 需要經(jīng)過(guò)脫鈣處理的特殊工序。對(duì)病理活檢蘇木精-伊紅染色（HE染色）的效果不會(huì)構(gòu)成比較大的影響， 但是在很大程度上會(huì)影響到免疫組化染色抗原性[2]。近些年， 微波輻射技術(shù)逐步深入應(yīng)用到骨組織脫鈣、免疫組化染色、抗原修復(fù)等， 且效果突出， 特別是EDTA快速脫鈣、微波-低溫硝酸等技術(shù)對(duì)最大化地保留脫鈣組織的抗原性做出了重要的貢獻(xiàn)[3， 4]， 而光波+微波脫鈣到底對(duì)免疫組化染色抗原性的實(shí)際影響在文獻(xiàn)報(bào)道中鮮見。

本組研究中光波-微波組合Ⅱ脫鈣時(shí)間在集中脫鈣方法中是最短的， 而室溫下的骨組織與切片呈現(xiàn)出淡黃色， 脫鈣時(shí)間最長(zhǎng)。就免疫組化染色效果來(lái)說(shuō)， 室溫條件下的脫鈣組織最差， 微波、光波條件下的脫鈣組織相對(duì)較好， 光波+微波組合Ⅰ、光波+微波組合Ⅱ條件下的脫鈣組織最好， 主要是因?yàn)槲⒉ㄅc光波的雙重作用促使了骨組織的鈣鹽的反應(yīng)速度進(jìn)一步加快， 使得過(guò)去的常規(guī)脫鈣方法少至數(shù)小時(shí)多則幾天的反應(yīng)時(shí)間大大縮短以致在短時(shí)間內(nèi)便可完成， 因而最大化地保留了抗原性， 提高了免疫組化染色的效果。

在光波+微波-硝酸脫鈣的應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)注意如下幾方面：①微波與光波的雙重作用會(huì)使得脫鈣液溫度在短時(shí)間內(nèi)迅速升高， 因此結(jié)合預(yù)冷降溫措施可很好地減輕溫度對(duì)抗原性的影響[5]。②不宜使用金屬容器盛裝脫鈣液， 且要保證充足的脫鈣液量， 通常情況上要達(dá)到標(biāo)本的20～30倍左右， 并要更換1～2次新液。③骨組織厚薄適宜， 5 mm左右為最宜， 以防脫鈣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而損及組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、影響染色效果。

綜上所述， 8%硝酸光波+微波組合脫鈣時(shí)間要明顯短于微波、光波及室溫脫鈣， 且具有良好的免疫組化染色效果。

參考文獻(xiàn)

[1]楊傳紅， 賴晃文， 唐云， 等.微波快速脫鈣及其脫鈣液的選擇. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志， 2010， 12（4）：357-358.

[2]劉海芳. HE染色切片褪色后免疫組化染色方法研究.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生， 2011， 49（17）：81-82.

[3]熊正文， 李宏偉， 黃勇， 等.骨組織脫鈣技術(shù)及在免疫組化染色中的應(yīng)用研究.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志， 2011， 14（3）：175-178.

[4]熊正文， 朱光君， 黃勇， 等.骨組織的脫鈣及其免疫組織化學(xué)染色技術(shù)探討.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志， 2010， 11（3）： 347-349.

[5]張緒斌， 熊正文， 張華東.骨組織脫鈣技術(shù)及其應(yīng)用.醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐， 2011， 24（11）：1264-1267.

[收稿日期：2015-12-24]