劉霄卉 ，羅軍榮,2，斯日古楞，周建華，馬學(xué)恩*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院，江西 南昌 330045；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150001)

綿羊肺腺瘤病(Ovine pulmonary adenomatosis,OPA)又名“驅(qū)趕病”(Jaagsiekte)，是引發(fā)綿羊肺臟腫瘤的一種接觸性傳染病，偶發(fā)生于山羊。其病原為綿羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte retrovirus，JSRV)，該病毒屬于β反轉(zhuǎn)錄病毒，基因組為線性單股正鏈RNA，全長(zhǎng)7.4 kb，具相互重疊的 gag、pro、pol、env基因。其中env基因的ORF編碼囊膜蛋白Env。該蛋白隨后被病毒蛋白酶水解為跨膜蛋白(Transmembrane protein，TM)和表面蛋白(Surface protein，SU)[1]。研究表明，SU位于病毒的囊膜外，包含受體結(jié)合位點(diǎn)和主要的抗原決定簇，并通過識(shí)別結(jié)合相應(yīng)的特異性受體，介導(dǎo)膜融合過程，進(jìn)而使病毒粒子侵入宿主細(xì)胞內(nèi)，Caporale等發(fā)現(xiàn)，JSRV Env蛋白是致瘤蛋白[3,5-8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，缺失Env蛋白中的TM會(huì)導(dǎo)致該蛋白失去細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，表明TM為Env細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的決定因素之一[4]。此外，缺失SU的信號(hào)肽到SU與TM的連接區(qū)域也使Env喪失轉(zhuǎn)化能力，表明SU蛋白中也可能有多個(gè)區(qū)域參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化[10]。SU在JSRV ENV細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用似乎依賴于靶細(xì)胞的類型，但如何影響這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)化尚不明確[2]。SU在JSRV細(xì)胞轉(zhuǎn)化中作用是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。SU可用于檢測(cè)OPA特異抗原及OPA發(fā)病機(jī)理的研究[9]。

本研究利用真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建了JSRVsu基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-SU，并轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，建立了穩(wěn)定表達(dá)SU的A549細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究SU蛋白在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體購自Invitrogen公司；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞和A549細(xì)胞株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；重組原核表達(dá)質(zhì)粒(pGEX-4T-1-SU)由本課題組構(gòu)建保存[11]；抗SU單克隆抗體(MAb)由本室制備[12]。

1.2 主要試劑和工具酶 限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；凝膠回收、質(zhì)粒抽提純化試劑盒購自O(shè)MEGA公司；真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；F-12K細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)及篩選用G418購自GIBCO公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自中山金橋公司；熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自Sigma公司；超敏發(fā)光液購自普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank登錄的JSRV-NM株env基因(DQ838494)SU區(qū)序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，并引入限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)以及翻譯起始密碼子和終止密碼子。上游引物(SU-F)為：5'-GGAATTCATGTTACAGCGGATAC-3'；下游引物(SU-R)為：5'-CCCTCGAGTCAGCTAAGAGTCGTG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為898 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 以pGEX-4T-1-SU為模板，SU-F、SU-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的目的基因純化后，與pcDNA3.1(+)同用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切處理，并經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌。轉(zhuǎn)化后所得的菌落用PCR法、限制性內(nèi)切酶及DNA測(cè)序鑒定。將鑒定正確的陽性克隆菌用去內(nèi)毒素小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1-SU。重組質(zhì)粒用XbaⅠ消化并純化后用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及純度，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 表達(dá)SU蛋白的細(xì)胞系建立

1.5.1 G418工作濃度確定 為測(cè)定抗性細(xì)胞篩選試劑G418對(duì)A549細(xì)胞最小致死量，將A549細(xì)胞以0.5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入終濃度分別為100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L和 600 mg/L G418，于 37℃5%CO2條件下培養(yǎng)，每3 d換液一次，共培養(yǎng)15 d～20 d，觀察A549細(xì)胞生長(zhǎng)情況。以細(xì)胞完全死亡的G418最小濃度為篩選的最佳工作濃度。

1.5.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，用含10%FBS的F-12K培養(yǎng)液將A549細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。次日(細(xì)胞單層為90%～95%)，按轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書要求，取0.8 μg pcDNA3.1-SU質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，并設(shè)空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染作為對(duì)照。48 h后改用含終濃度500 mg/L G418的完全F-12K培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。

1.5.3 穩(wěn)定表達(dá)SU細(xì)胞系的建立 以有限稀釋法對(duì)陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆進(jìn)行連續(xù)3次克隆純化，以間接免疫熒光(IFA)方法檢測(cè)SU的表達(dá)，使其克隆孔免疫熒光陽性率達(dá)90%以上。陽性克隆的再擴(kuò)增培養(yǎng)以250 mg/L的G418維持，按常規(guī)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。建立穩(wěn)定表達(dá)JSRV SU的細(xì)胞株克隆保存于液氮。

1.6 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的鑒定

1.6.1 IFA鑒定 將克隆化后的細(xì)胞株以1×105細(xì)胞/孔接種于24孔板，同時(shí)以空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為陰性對(duì)照；未轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SU質(zhì)粒的A549細(xì)胞作為空白對(duì)照。以抗SU MAb為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行IFA反應(yīng)。

1.6.2 Western blot方法鑒定 收集克隆化的細(xì)胞系，以抗SU MAb為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，進(jìn)行western blot鑒定。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

1.7 表達(dá)蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位 將克隆化后的細(xì)胞株，同1.6.1方法進(jìn)行間接免疫熒光標(biāo)記，加入碘化丙啶(PI，100 μg/mL)于 4℃避光染核 15 min，PBST 漂洗3次，利用Laser scanning共聚焦顯微鏡分析表達(dá)的SU蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 穩(wěn)定表達(dá)SU細(xì)胞系的建立 以pGEX-4T-1-SU為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增JSRVsu基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，顯示的擴(kuò)增后條帶約為900 bp，與預(yù)期片段大小相符(圖1)。

從轉(zhuǎn)化菌中提取重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SU，經(jīng)PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定及核苷酸序列測(cè)定并比對(duì)分析后顯示，所克隆的su基因片段的讀碼框架和插入方向正確，表明構(gòu)建了含有su基因的pcDNA3.1-SU。將pcDNA3.1-SU線性化后轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，挑取G418抗性細(xì)胞克隆，經(jīng)3次有限稀釋法純化，建立了SU穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)549-SU。

2.2 穩(wěn)定表達(dá)SU細(xì)胞系的鑒定 以抗SU MAb為檢測(cè)抗體，對(duì)穩(wěn)定表達(dá)SU的細(xì)胞系A(chǔ)549-SU進(jìn)行IFA反應(yīng)，檢測(cè)SU的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況。顯微鏡觀察顯示所有細(xì)胞均呈現(xiàn)綠色熒光，而在空白對(duì)照和陰性對(duì)照中沒有觀察到熒光(圖2)，表明SU蛋白獲得表達(dá)。

2.3.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果 將A549-SU細(xì)胞裂解產(chǎn)物以抗SU MAb作為檢測(cè)抗體，進(jìn)行western blot。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SU轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞裂解物在35 ku處出現(xiàn)特異帶，而空白對(duì)照和陰性對(duì)照則沒有任何反應(yīng)帶(圖3)，表明克隆至表達(dá)載體中的su基因得到正確和有效的表達(dá)。

用標(biāo)記FITC抗SU MAb指示SU，以PI標(biāo)記細(xì)胞核，利用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，SU蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，但部分細(xì)胞的細(xì)胞核中也有少量存在(圖4)。

由于OPA感染羊血液中無循環(huán)性抗JSRV抗體的存在[8]，即沒有病毒陽性血清可檢測(cè)JSRV SU蛋白的表達(dá)，因此本研究以前期制備的抗SU MAb[12]檢測(cè)目的基因的表達(dá)。

通過IFA及western blot方法檢測(cè)證實(shí)，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SU可在真核細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)JSRV SU，而且蛋白分子量與預(yù)計(jì)相符。經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察，所有細(xì)胞均呈現(xiàn)綠色熒光，且熒光部位集中于細(xì)胞質(zhì)，而在細(xì)胞核中僅見微弱熒光，顯示SU主要定位于細(xì)胞質(zhì)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建含有su基因的pcDNA3.1-SU真核表達(dá)載體，建立了穩(wěn)定表達(dá)SU的細(xì)胞系A(chǔ)549-SU，為研究SU在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用以及對(duì)OPA發(fā)病機(jī)理的研究建立了體外研究重要平臺(tái)。

圖4 共聚焦分析結(jié)果Fig.4 Localization of su in A549 cells by confocal microscopy

[1]Demartini J,Bishop J,Allen T,et al.Jaagsiekte sheep retrovirus proviral clone JSRV(JS7),derived from the JS7 lung tumor cell line,induces ovine pulmonary carcinoma and is integrated into the surfactant protein A gene[J].J Virol,2001,75(9):239-246.

[2]Liu S L,Miller A D.Oncogenic transformation by the jaagsiekte sheep retrovirus envelope protein[P],Oncogene(2007)26,789-801.

[3]Maeda N,FU Wu-xia,Ortin A.Roles of the Ras-MEK-mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase-Akt-mTOR pathwaysin Jaagsiektesheep retrovirus-induced transformation of rodent fibroblast and epithelial cell lines[J].Virology,2005,79:4440-4450.

[4]Palmarini N,Maeda C,Murgia C,et al.A phosphatidylinositol 3-kinase docking site in the cytoplasmic tail of the Jaagsiekte sheep retrovirus transmembrane protein is essential for envelope-induced transformation of NIH 3T3 cells[J].Virology,2001,75:11002-11009.

[5]Marco C,Christina C,Patrizia C,et al.Expression of the Jaagsiekte sheep retrovirus envelope glycoprotein is sufficient to induce lung tumors in sheep[J].J Virol,2006,8:8030-8037.

[6]Griffiths D J,Martineau H M.Cousens.Pathology and pathogenesis of ovine pulmonary adenocarcinoma[J].Comp Path,2010,l:1-24.

[7]Rai S K,Duh F M.Candidate tumor suppressor HYAL2 is a glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchored cell-surface receptor for jaagsiekte sheep retrovirus,the envelope protein of which mediates oncogenic transformation[J].Proc Natl Acad Sci.USA 2001,98:4443-4448.

[8]Allen T E,Sherrill K J.The jaagsiekte sheep retrovirus envelope gene induces transformation of the avian fibroblast cell line DF-1 but does not require a conserved SH2 binding domain[J].Gen Virol,2002,83:27.

[9]Denis F Y,Robert V,Daniel W V.Isolation,identification,and partial cDNA clong of genomic RNA of jaagsiekte retrovirus,the etiological agent of sheep pulmonary adenomatosis[J].J Virol,1991,65:5061-5067.

[10]De Heras M,Ortin A,Benito A,et al.In-situ demonstration of mitogen-activated protein kinase Erk 1/2 signalling pathway in contagious respiratory tumours of sheep and goats[J].J Compara Pathol,2006,135:1-10.

[11]斯日古楞，么宏強(qiáng)，馬學(xué)恩，等.綿羊肺腺瘤病毒內(nèi)蒙毒株囊膜蛋白基因在大腸桿菌中的分段表達(dá)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007，10：7-10.

[12]劉霄卉，斯日古楞，羅軍榮，等.綿羊肺腺瘤病毒囊膜基因表面蛋白的表達(dá)及其單克隆抗體的制備[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，6：469-472.