石 躍，劉懷然，劉培欣，李東偉，楊 煦，華育平，孔憲剛*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001；2.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由 ND病毒(NDV)引起，主要危害家禽的一種急性、高度接觸性傳染病[1]。我國(guó)對(duì)ND的防控采用的是嚴(yán)格的疫苗免疫，已經(jīng)基本上控制了ND的流行，但與此同時(shí)來(lái)自疫苗的免疫壓力和宿主的選擇壓力也加速了NDV的變異。近年來(lái)不斷有高水平免疫雞群發(fā)生病例，以及NDV感染家養(yǎng)水禽鴨、鵝發(fā)病的報(bào)道。野生水禽被認(rèn)為是NDV的天然宿主，體內(nèi)多攜帶對(duì)雞無(wú)致病性的NDV弱毒株，但有證據(jù)表明家禽爆發(fā)ND與持續(xù)存在于野鳥體內(nèi)的NDV有關(guān)[2]。本研究對(duì)從黑龍江地區(qū)獲得的一株野鴨源NDV分離株進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定，表明該病毒株的ICPI值達(dá)到強(qiáng)毒株的標(biāo)準(zhǔn)，而基因組測(cè)序結(jié)果顯示它與疫苗株Mukteswar同源性很高。本研究為進(jìn)一步了解野鳥源病毒株與疫苗株的潛在關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料 NDV Mallard/CH/HLJ383/06(簡(jiǎn)稱WB383)，分離于2006年采自黑龍江三江自然保護(hù)區(qū)野生綠頭鴨泄殖腔拭子，拭子樣品由東北林業(yè)大學(xué)提供；9日齡～10日齡SPF雞胚、1日齡及15日齡SPF雞均由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株(F48E9)陽(yáng)性血清、DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；TRIzol reagent購(gòu)自Invitrogen公司；M-MLV購(gòu)自MBI Fermentas公司；ExTaq、dNTP、pMD18-T均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 病毒純化及F基因擴(kuò)增 鑒定為陽(yáng)性的NDV按常規(guī)方法在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上進(jìn)行蝕斑純化[3]。用引物P4358(5'-GCCATTGCCTAAATACAAT CC-3')和引物 P6031(5'-GGCTCCTCTTACCGTTCTA C-3')擴(kuò)增全長(zhǎng)F基因，克隆至pMD18-T載體中，進(jìn)行序列測(cè)定。參照GenBank登錄的NDV各參考病毒株F基因序列構(gòu)建F基因遺傳進(jìn)化樹。

1.3 1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)測(cè)定 將蝕斑純化的NDV分離株按照OIE方法進(jìn)行1日齡雛雞ICPI的測(cè)定，共測(cè)定兩次。

1.4 15日齡SPF雞致病性試驗(yàn) 取10只15日齡SPF雞，以103TCID50/0.1 mL劑量通過滴鼻點(diǎn)眼方式接種WB383分離株，隔離器飼養(yǎng)3周，記錄SPF雞的發(fā)病和死亡情況，接種5 d后取3只雞剖檢，觀察病變情況，并檢測(cè)存活雞的血清抗體效價(jià)。

1.5 病毒全基因組序列測(cè)定與分析 根據(jù)WB383分離株F基因序列分析結(jié)果，參照GenBank登錄的Mukaswar株序列(EF201805)，設(shè)計(jì)11對(duì)引物用于擴(kuò)增WB383病毒基因組全長(zhǎng)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(如果需要引物序列作者可以提供)。擴(kuò)增片段克隆至pMD18-T載體中，由北京六合華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 F基因進(jìn)化分析 自野生綠頭鴨的泄殖腔拭子分離出一株具有血凝性病毒，經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)鑒定為NDV，命名為Mallard/CH/HLJ383/06，簡(jiǎn)稱WB383。RT-PCR擴(kuò)增其F基因核苷酸序列，將其測(cè)序結(jié)果與NDV參考株進(jìn)行比較，結(jié)果表明WB383株與Mukteswar同源性最高為99.9%，屬于ClassⅡ的基因Ⅲ型(圖 1)。

2.2 致病性試驗(yàn) 對(duì)WB383分離株進(jìn)行的兩次ICPI指數(shù)測(cè)定平均值為1.81，明顯高于NDV中等毒力病毒株判斷標(biāo)準(zhǔn)(ICPI<1.50)(表1)。結(jié)果表明，與最近報(bào)道的江蘇分離株鑒定結(jié)果相似，基因Ⅲ型病毒株ICPI值均有所升高[10]，接近近年來(lái)我國(guó)流行的基因Ⅶ型NDV的ICPI值水平。15日齡SPF雞致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示接種3 d后，均出現(xiàn)臨床發(fā)病癥狀，無(wú)死亡病例。接種后5 d，剖檢可見2/3雞腺胃壁變薄，乳頭覆蓋大量粘液，乳頭突起不明顯，無(wú)出血現(xiàn)象；接種后14 d，血清抗體血凝抑制效價(jià)達(dá)到1∶25～1∶28，表明它對(duì)于15日齡SPF雞的致病力仍低于同水平ICPI值的基因VII型NDV株[4]。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然野鳥源病毒株WB383的ICPI值已達(dá)到強(qiáng)毒株判斷標(biāo)準(zhǔn)，但仍屬于基因Ⅲ型中發(fā)型病毒株，致病性的改變也許正處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程中，有潛在引起雞群發(fā)病的可能。

表1 Mallard/CH/HLJ383/06與其他NDV毒株的ICPI值比較Table 1 ICPI value comparision of Mallard/CH/HLJ383/06 with other NDV strains

2.3 全基因序列比較 通過RT-PCR擴(kuò)增出11條目的片段，測(cè)序后通過DNAStar軟件進(jìn)行拼接。結(jié)果表明，WB383病毒株的基因組全長(zhǎng)為15186 nt，長(zhǎng)度與基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型等較古老的基因型NDV株相同，基因組長(zhǎng)度符合“6的整數(shù)倍”原則[5]。在GenBank登錄的NDV全長(zhǎng)序列中，WB383與Mukteswar株、JS/705/Ch株、JS/9/05/Go株同源性最高，核苷酸同源性高達(dá)99%以上，結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸同源性為99.0%～99.7%。

NDV F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸序列是決定病毒毒力主要因素之一，強(qiáng)毒株在該位點(diǎn)的氨基酸基序?yàn)?12R/KRQK/RRF117，而弱毒株基序則為112G/EK/RQG/ERL117。HN蛋白具有受體識(shí)別和神經(jīng)氨酸酶的作用，與病毒的嗜性相關(guān)，也是NDV重要的毒力相關(guān)因子之一[6]。近年來(lái)，隨著NDV反向遺傳操作系統(tǒng)的建立和應(yīng)用，研究表明除了F和HN基因外，其他幾個(gè)基因也與NDV毒力相關(guān)[7]。Rout等研究表明NDV的L蛋白通過影響病毒的復(fù)制水平影響病毒的毒力，所以該蛋白的變化對(duì)NDV毒力演化的作用很關(guān)鍵[8]。

Mukteswar病毒株是從印度分離強(qiáng)毒株經(jīng)雞胚致弱多代獲得的，是我國(guó)Ⅰ系疫苗株的原始病毒株[9]。雞源JS/7/05/Ch株和鵝源JS/9/05/Go株與疫苗株Mukteswar同源性最高，但它們的ICPI值卻高于Mukteswa株，同時(shí)由于我國(guó)一直沒有基因Ⅲ型強(qiáng)毒NDV流行的報(bào)道，偶爾分離到的基因Ⅲ型病毒株與Mukteswar具有很高的同源性，由此推測(cè)這兩株分離株很可能是疫苗株Mukteswar的返強(qiáng)病毒株[10]。

WB383與Mukteswar全基因組序列間核苷酸同源性高達(dá)99.8%，共有33個(gè)核苷酸差異，導(dǎo)致16個(gè)氨基酸突變，低于JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go變異的25個(gè)氨基酸。WB383株與Mukteswar株相比變異的16個(gè)氨基酸中，有9處氨基酸變異為WB383株所獨(dú)有，而Mukteswar與JS/7/05/Ch、JS/9/05/Go株在此處相同(表2)。分析這4株病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，F(xiàn)蛋白差別最小，WB383、JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go與疫苗株Mukteswar的F蛋白僅在氨基酸203位發(fā)生A-T的一致性變異；HN蛋白同源性差別最大，在0.7%～1.8%之間且變異的15處氨基酸位點(diǎn)均不相同，這可能主要與3株病毒分離自不同的宿主有關(guān)；L蛋白發(fā)生氨基酸變異的點(diǎn)也較多，WB383株與Mukteswar株相比較有5處變異，JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go均為13處變異。相對(duì)于Mukteswar疫苗株，WB383、JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go株有4處一致性氨基酸變異。雖然3株病毒的主要毒力因子F和HN蛋白的氨基酸殘基相比于Mukteswar株都發(fā)生了改變，但是三者發(fā)生一致性突變的位點(diǎn)卻多集中在L基因上。據(jù)此，我們推測(cè)WB383株與JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go分離株一樣可能為疫苗株Mukteswar在不同宿主體內(nèi)進(jìn)化而來(lái)，由于宿主或免疫壓力而發(fā)生變異，這些變異以點(diǎn)突變?yōu)橹鳎e累到一定程度引起致病性的改變。至于HN蛋白及L蛋白的氨基酸點(diǎn)變異是否與病毒嗜性、毒力是否相關(guān)，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 Mukteswar株與WB383、JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go蛋白變異位點(diǎn)Table 2 Protein and mutation site of NDV strains Mukteswar and WB383,JS/7/05/CH,JS/9/05/Go

綜上所述，自不同地區(qū)(江蘇，黑龍江)及不同禽源(雞、野鴨、鵝)均分離到與疫苗株同源病毒株，而且毒力升高或具有升高趨勢(shì)，表明NDV可以在雞群-家養(yǎng)水禽-野生水禽間傳播而形成一個(gè)天然的NDV循環(huán)庫(kù)，并在宿主選擇壓力及其它因素作用下發(fā)生變異，進(jìn)而導(dǎo)致宿主嗜性及致病性改變。現(xiàn)階段應(yīng)擴(kuò)大NDV流行病學(xué)監(jiān)測(cè)范圍，加強(qiáng)對(duì)野鳥特別是野生水禽的NDV流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，為ND防控和新型疫苗研制提供數(shù)據(jù)。

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