白 娟，蔣康富，李玉峰，王先煒，姜 平

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)是單股正鏈RNA病毒,屬于微RNA病毒科心病毒屬的成員。EMCV可感染多種哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)和人類(lèi)等，嚙齒類(lèi)動(dòng)物是EMCV的自然宿主，其中豬是受感染最普遍的動(dòng)物。EMCV感染可引起斷奶仔豬的急性心肌炎、突然死亡和母豬的繁殖障礙[1-2]。嚙齒類(lèi)動(dòng)物和帶毒成年動(dòng)物是該病的主要傳染源。鼠作為EMCV的自然宿主和傳播者，對(duì)于該病毒在豬群中的流行起到重要作用[3]。

EMCV基因組全長(zhǎng)約7.8 kb。EMCV的衣殼蛋白由4種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4組成。除這4種結(jié)構(gòu)蛋白外，還含有非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B以及蛋白酶3C和RNA依賴性聚合酶3D[4]。1958年，豬EMCV作為仔豬致死性心肌炎的病原首次被報(bào)道[5]。2005年蓋新娜等首次在國(guó)內(nèi)分離和鑒定了該病毒[6]，至今我國(guó)已分離到4株豬源和1株鼠源EMCV，并對(duì)其全基因組序列進(jìn)行分析[7-9]。本研究目的是對(duì)本實(shí)驗(yàn)室所分離的EMCV NJ08株進(jìn)行全基因測(cè)序，并與國(guó)內(nèi)外分離病毒株進(jìn)行同源性比較，從而確定該分離株的來(lái)源和遺傳變異，同時(shí)可以豐富國(guó)內(nèi)分離株的基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)，為研究EMCV的基因遺傳和變異提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要試劑 EMCV NJ08分離株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；BHK21細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC；AccuPrimeTMPfx DNA Polymerase、dNTP Mixture和M-MLV等均購(gòu)自Invitrogen公司；pMD18-T vector、DNA A-Tailing Kit、5'-Full RACE Kit和 3'-Full RACE Core Set Ver.2.0均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 參考EMCV BJC3株(DQ464062)的核苷酸序列設(shè)計(jì)并合成覆蓋ORFs的特異性引物(如讀者需要作者可以提供)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這7個(gè)重疊片段含蓋了整個(gè)基因組。

1.3 總RNA提取 取EMCV病毒培養(yǎng)液，按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)，提取總RNA。

1.4 RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄：利用各片段特異性引物，以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄生成相應(yīng)片段的cDNA鏈。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并優(yōu)化PCR的最佳反應(yīng)體系(25 μL)和反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)條件設(shè)定為：95℃ 2 min；95℃ 30 s、57℃～60℃ 45 s、68℃1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃10 min?；蚪M3'末端和5'末端擴(kuò)增方法參見(jiàn)3'-RACE試劑盒和5'-RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 擴(kuò)增基因片段克隆測(cè)序 RT-PCR擴(kuò)增的目的基因片段純化回收后與pMD18-T連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、篩選陽(yáng)性克隆。鑒定的陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒由Invitrogen公司測(cè)序。利用DNAStar軟件包中的MegAlign程序和測(cè)序峰圖軟件Chromas2.22對(duì)各片段測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得NJ08株全基因組序列。

1.6 同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析 采用DNAStar軟件包中的MegAlign程序，將NJ08株與GenBank中登錄的其它EMCV參考株的全基因組序列、各片段的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 EMCV基因組分段擴(kuò)增、測(cè)序及序列拼接 利用RT-PCR和RACE方法擴(kuò)增出了包含EMCV NJ08分離株全部基因組的7個(gè)cDNA片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(圖1)。各片段產(chǎn)物經(jīng)純化、連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序，測(cè)序由上海英駿生物工程有限公司完成。測(cè)序結(jié)果表明，3'-UTR、F1～F5、5'-UTR這7個(gè)片段的大小分別為316 bp、1526 bp、1580 bp、2146 bp、1002 bp、1316 bp和714 bp。經(jīng)拼接 EMCV NJ08分離株基因組全序列(NO：HM641897)。

2.2 EMCV NJ08分離株的基因組組成和結(jié)構(gòu)分析NJ08分離株基因組全長(zhǎng)7724 bp其中5'-UTR為714 bp，3'-UTR為 131 bp，中間為一個(gè)大 ORF(6879 bp)編碼由2292個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白，該多聚蛋白最終切割成11個(gè)蛋白終產(chǎn)物：VP1～VP4、2A～2C、3A～3D和一個(gè)病毒自身編碼的前導(dǎo)蛋白(L蛋白)，其基因組組成簡(jiǎn)圖如圖2所示。

2.3 EMCV NJ08基因組核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸與其他病毒株的比較 將NJ08株的核苷酸序列與國(guó)內(nèi)外EMCV參考株全基因組序列比較分析，同源性在81.2%～99.8%之間，其中與國(guó)內(nèi)分離株GXLC、GX0602、BJC3、HB1以及國(guó)外分離株CBNU、K3、K11、BEL-2887A、PV21、EMCV-R、PEC9等同源性很高，達(dá)99.6%以上，與國(guó)外分離株D variant、EMC-B、EMC-D、Mengo-M、Mengo Rz-pMwt等同源性較低，為81.2%～83.9%。各個(gè)蛋白編碼區(qū)的核苷酸、氨基酸序列的同源性分析結(jié)果表明，該病毒非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)比結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)保守，非結(jié)構(gòu)蛋白中3D最為保守、2A變異最大，結(jié)構(gòu)蛋白中VP2最為保守、VP1變異最大。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析 系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，EMCV可分為2個(gè)亞群：Ia亞群和Ib亞群，豬源EMCV屬于Ia或Ib亞群，鼠源EMCV屬于Ia亞群。NJ08與國(guó)內(nèi)分離株GXLC，GX0602，BJC3及HB1同屬于Ia亞群，而且與BEL-2887A、CBNU、K3、K11等國(guó)外分離株親緣關(guān)系較近，提示EMCV存在一定的地域差異(圖3)。

EMCV是近幾年來(lái)我國(guó)新出現(xiàn)的一種病毒，但研究報(bào)道還不多。NJ08株分離于南京某發(fā)病仔豬，可以引起小鼠發(fā)病死亡。本研究應(yīng)用RT-PCR、3'-RACE和5'-RACE技術(shù)克隆獲得該病毒全基因組。分析結(jié)果表明，NJ08株與 BEL-2887A、CBNU、K3、EMCV-R、PV21等國(guó)外分離株同源性達(dá)99%以上，與分離于1990年的K3、K11株[10]全基因組序列的同源性達(dá)到99.6%，豬源病毒株NJ08與鼠源病毒株GX0602全基因組序列的同源性達(dá)到99.6%。表明近幾年來(lái)源于不同國(guó)家的豬源EMCV基因組序列高度同源，分離于不同時(shí)間的豬源EMCV基因組序列高度同源，豬源EMCV與鼠源EMCV的親緣關(guān)系較近。綜上所述，對(duì)NJ08株全基因序列的測(cè)定與分析，將為相關(guān)疫苗的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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