李英利，常繼濤，于 力

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/大動(dòng)物病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001)

牛腸道病毒(Bovine enterovirus，BEV)是小RNA病毒科腸道病毒屬的成員。病毒粒子呈球形，二十面體，無(wú)囊膜，完整病毒粒子直徑約為25 nm～30 nm。病毒基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約為7.5 kb，可直接作為mRNA翻譯出一個(gè)多聚蛋白，經(jīng)過(guò)一系列降解，產(chǎn)生4種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3和 VP4)和 7種非結(jié)構(gòu)蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C 和 3D)[1]。1959年 Moll和Davis首次分離到BEV[2]，隨后其他國(guó)家也相續(xù)有BEV的分離報(bào)道[3-5]。1988年Earle等首次發(fā)表了BEV的全基因組序列[6]，目前在GenBank登錄的全基因組序列有12條。1993年，Smyth等獲得了BEV粒子的晶體，并且展示了它的三維立體形態(tài)[7]。BEV對(duì)酸堿和溫度具有較強(qiáng)的耐受能力。Sedmak等發(fā)現(xiàn)BEV是小鼠許多腫瘤疾病的融瘤因子[8]。因此，BEV在腫瘤疾病的防制和病毒載體的開發(fā)上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究從采自我國(guó)部分地區(qū)奶牛場(chǎng)的牛糞便拭子樣品中分離出一株BEV，該病毒的分離在國(guó)內(nèi)尚屬首次。

1 材料和方法

1.1 病料及實(shí)驗(yàn)材料 牛糞便樣品系2008年采自內(nèi)蒙古某奶牛場(chǎng)，-70℃凍存；MA104細(xì)胞為本研究室保存；培養(yǎng)液為含8%胎牛血清的DMEM。

1.2 主要試劑 PrimeSTAR DNA聚合酶、Primescript反轉(zhuǎn)錄酶、Oligo(dT)引物均購(gòu)自TaKaRa公司；TRIzol購(gòu)自Gibco BRL公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司。

1.3 樣品處理 采集的糞便樣品，用PBS制成1∶10(W/V)懸液，漩渦振蕩器震蕩，反復(fù)凍融3次，3000 r/min，4℃離心10 min，取上清，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌后，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒的分離培養(yǎng) 經(jīng)處理的糞便樣品，接種MA104細(xì)胞單層，37℃吸附1 h，加入無(wú)血清的DMEM，5%CO237℃培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)。

1.5 病毒粒子的電鏡觀察 取病毒培養(yǎng)物上清，接種單層MA104細(xì)胞，6 h～8 h后，制備超薄切片進(jìn)行電鏡觀察。

1.6 PCR引物的設(shè)計(jì) 參照GenBank中登錄的BEV全基因組序列，選擇保守區(qū)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增包含部分3D基因和全長(zhǎng)3'UTR區(qū)段的上下游引物。6424U24：5'-ATCCAAAGAGAAAGTGAAGAAGGG-3'； 7450L24： 5'-CCGGGGGCCTTTTTTTTTTTTTTT-3'。為調(diào)整下游引物的GC含量，在5'端引入了G、C堿基(引物下劃線部分)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.7 病毒RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增 采用TRIzol試劑按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行操作提取總RNA。細(xì)胞培養(yǎng)物的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cNDA鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min；94℃30 s、55℃30 s、72℃90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.8 DNA序列測(cè)定及分析 RT-PCR產(chǎn)物膠回收純化后，由英駿(中國(guó))生物技術(shù)公司測(cè)序。利用DNAStar軟件分析測(cè)序結(jié)果，并與國(guó)外具有的代表性參考病毒株進(jìn)行序列比較分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒的分離 糞便樣品處理后的上清接種MA104單層細(xì)胞中進(jìn)行病毒培養(yǎng)分離。傳至第2代，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮變圓、邊緣模糊、集聚和漂落(圖1)。對(duì)分離的病毒進(jìn)行3次蝕斑純化，進(jìn)行下一步的鑒定。

2.2 電子顯微鏡觀察結(jié)果 單層細(xì)胞接種病毒后6 h～8 h，制備超薄切片，進(jìn)行電子顯微鏡觀察。在細(xì)胞質(zhì)中可見勻稱排列的病毒粒子的結(jié)晶，單個(gè)病毒粒子的直徑大約25 nm～30 nm，無(wú)囊膜結(jié)構(gòu)(圖2)，與小RNA病毒的形態(tài)特征相符[9]。

2.3 病毒基因RT-PCR擴(kuò)增 經(jīng)過(guò)3次噬斑純化的病毒，抽提RNA，用Oligo(dT)通用引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，用6424U24和7450L24引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期大小(1026 bp)相符的目的基因片段(圖3)。

2.4 序列比較分析 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，應(yīng)用DNAStar軟件將測(cè)得的序列與GenBank登錄的BEV不同病毒參考株相應(yīng)序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，擴(kuò)增的目的片段與參考病毒株的核苷酸序列同源性為71.9%～87%，同美國(guó)的Wye-3A株(AY508697)[10]的同源性最高，為87%(圖4)。

本研究從犢牛糞便樣品中分離到1株能夠穩(wěn)定產(chǎn)生CPE的病毒，經(jīng)電鏡觀察、RT-PCR及序列分析鑒定，該分離病毒株為BEV，命名為BHM26。BEV可在患消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病及繁殖障礙性疾病的牛體內(nèi)獲得分離，也可以在正常牛體內(nèi)獲得分離，還可在環(huán)境中獲得分離；而且，用BEV分離株進(jìn)行感染試驗(yàn)，很難復(fù)制出相應(yīng)的臨床癥狀。因此，目前認(rèn)為，BEV不具有致病性或僅有微弱的致病性。同時(shí)，BEV對(duì)酸堿具有較強(qiáng)的耐受能力，在環(huán)境中能夠穩(wěn)定存在，因此具有用于開發(fā)疫苗載體的潛在價(jià)值。

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