劉慶偉，邱亞峰，王曉杜，郭 林，劉 超，沈 陽，李向東，單 虎，馬志永*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生實驗室，上海 200241；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109)

偽狂犬病(Pseudorabies)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)感染豬和其它動物引起的重要傳染性疾病，自1902年發(fā)現(xiàn)以來呈世界性流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來經(jīng)濟損失，成為僅次于口蹄疫和豬瘟的主要疫病之一[1-2]。PRV屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，其基因組為線性雙股DNA分子，全長約150 kb，編碼70種～100種蛋白[3-4]，其中糖蛋白gH作為病毒復(fù)制的必需蛋白，在病毒侵入靶細胞及病毒在細胞間的擴散過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。研究表明，gH蛋白為Ⅰ型膜蛋白，其原始翻譯產(chǎn)物由686個氨基酸(aa)組成，包括信號肽(1 aa～29 aa)、膜外區(qū)(30 aa～646 aa)、跨膜區(qū)(647 aa～667 aa)和膜內(nèi)區(qū)(668 aa～686 aa)[7]，其中膜外區(qū)對于病毒與細胞融合具有重要作用。本研究以制備的抗PRV gH的多克隆抗體檢測PRV感染細胞中g(shù)H蛋白的表達情況，初步探討感染細胞中PRV的復(fù)制情況。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及實驗動物 PRV Bartha株(5×106TCID50/0.1 mL)由上海市農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所繆德年博士惠贈；pET-28a(+)購自Novagen公司；大腸桿菌BL21(DE3)和Vero細胞由本實驗室保存；新西蘭大白兔購于上海萬祥醫(yī)用實驗動物飼養(yǎng)場。LA Taq、dNTP及限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自Invitrogen公司；His·Bind純化試劑盒購自Novagen公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑購自Sigma公司；ECL發(fā)光試劑盒購自Pierce公司；抗p53抗體為本實驗室制備并保存[8]；FITC-羊抗兔IgG和HRP-羊抗兔IgG購自Santa cruz公司；Protein ladder購自Fermentas公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物科技研究所。

1.2 引物設(shè)計及目的基因擴增 按照博大泰克基因組提取試劑盒操作說明書抽提病毒基因組。根據(jù)GenBank中登錄的 PRV gH序列(M61196)，采用Primer 5.0軟件設(shè)計一對引物：上游引物：5'-TCAT GGATCCGCGCCGCAGGGTGGGCC-3'；下游引物：5'-CGCCAAGCTTGCGCCGCCGACAGCTGGGC-3'，擴增的長度為660 bp，引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成。以PRV Ba株基因組為模板，PCR反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃30 s、67℃30 s、72℃1 min，33個循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)體系加1%DMSO，1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

1.3 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pET-28a(+)載體和PCR產(chǎn)物，按試劑盒說明回收載體和基因片段，常規(guī)方法構(gòu)建重組質(zhì)粒，BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名為pET-gHN660，并由Invitrogen公司測序。

1.4 誘導(dǎo)表達及純化重組蛋白 pET-gHN660轉(zhuǎn)化E.coliBL21，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達，離心收集菌體，菌體裂解緩沖液(0.5 M NaCl，20 mM Tris，pH7.9，10 mM咪唑，0.2 mg/mL溶菌酶)重懸菌體，37℃水浴10 min，冰浴條件下超聲波處理誘導(dǎo)菌，離心后包涵體溶解緩沖液(0.5 M NaCl，20 mM Tris，pH7.9，10 mM咪唑，6 M 尿素)溶解沉淀，His·Bind純化試劑盒純化重組蛋白，SDS-PAGE分析誘導(dǎo)產(chǎn)物及純化產(chǎn)物，同時設(shè)陰性對照，并拍照記錄結(jié)果。

1.5 制備抗PRV gH抗體 純化的gH重組蛋白與完全弗氏佐劑等體積混合乳化，多點背部皮下免疫健康雌性新西蘭大白兔500 μg/只。14 d后純化gH重組蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混合乳化加強免疫，28 d再次加強免疫后2周，迫殺，收集血清，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 間接ELISA檢測 純化gH重組蛋白0.1 μg/孔包被ELISA板，37℃2 h；1%BSA封閉，37℃2 h；10倍梯度稀釋收集的血清為一抗，37℃2 h；HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG(1∶20000)，37℃ 1 h。OPD-H2O2系統(tǒng)顯色，2%H2SO4中止，檢測OD490nm值，同時設(shè)陰性對照和空白對照。

1.7 Western blot檢測 制備樣品進行12%凝膠SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印NC膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，適宜比例稀釋的一抗室溫孵育2 h，HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，加適當(dāng)量的ECL發(fā)光試劑暗室曝光膠片顯影。

1.8 IFA分析 PRV(5 MOI)感染Vero細胞12 h后，4%多聚甲醛室溫固定20 min，1%NP40室溫打孔5 min～10 min，10%的正常羊血清(NGS)室溫封閉30 min，獲得的抗PRV gH抗體(1∶100)或免疫前兔血清(1∶100)為一抗37℃孵育30 min，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔 IgG(1∶500)為二抗 37℃孵育 30 min，加入DAPI室溫染色5 min，50%甘油封片熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 PRV gHN660基因的擴增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建及序列分析 PCR擴增PRV gH基因部分序列獲得約660 bp基因片段gHN660(圖1-A)。構(gòu)建的原核表達質(zhì)粒pET-gHN660經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切得到約660 bp的基因片段(圖1-B)，與預(yù)期相符。測序分析表明插入的DNA序列方向正確，PRV gHN660閱讀框與5'上游His-tag閱讀框架相融合。

2.2 gH重組蛋白的表達純化 重組菌IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE電泳分析誘導(dǎo)的菌體和超聲產(chǎn)物的上清及沉淀溶解物發(fā)現(xiàn)重組蛋白在大腸桿菌中獲得大量表達，主要以包涵體的形式存在。按His Bind純化試劑盒說明書純化重組蛋白，SDS-PAGE電泳分析洗脫產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，在約29 ku出現(xiàn)目的條帶，同理論分子量相符(圖2)。

2.3 抗PRV gH抗體ELISA效價的檢測 間接ELISA法檢測所收集血清效價，陰性對照為未免疫的兔血清，空白對照為PBS。ELISA結(jié)果表明，1∶100到1∶100000梯度稀釋的血清與純化gH重組蛋白特異結(jié)合，抗體效價達1∶100000。

2.4 抗PRV gH抗體western blot分析結(jié)果 純化的gH和p53重組蛋白SDS-PAGE電泳后進行western blot分析，一抗為抗PRV gH(1∶5000)，檢測到大小約為29 ku的特異條帶，但不能與帶His標(biāo)簽的p53重組蛋白結(jié)合(圖3)，本實驗室制備的兔抗豬p53多克隆抗體(anti-p53)[8]為一抗檢測到大小為48 ku的特異條帶，不與帶His標(biāo)簽的p53重組蛋白結(jié)合(圖3)，表明所得抗PRV gH與純化的gH重組蛋白特異性好。

2.5 PRV感染細胞中g(shù)H蛋白的表達分析 PRV(5 MOI)感染Vero細胞12 h后收集細胞樣品，未感染Vero細胞樣品為陰性對照，抗PRV gH抗體為一抗，western blot檢測到大小約95 ku的病毒gH蛋白糖基化形式，陰性對照未出現(xiàn)任何條帶(圖4-A)，PRV感染Vero細胞樣品和未感染Vero細胞樣品的內(nèi)參蛋白actin的表達一致。IFA結(jié)果表明，抗PRV gH抗體檢測到gH蛋白主要分布于細胞漿內(nèi)，免疫前兔血清在感染病毒細胞沒有檢測到信號(圖4-B)，表明抗PRV gH抗體可以特異地識別感染細胞中的PRV gH蛋白。

2.6 gH在PRV感染細胞過程中表達的western blot分析 利用獲得的抗PRV gH抗體分析PRV復(fù)制過程中g(shù)H蛋白的變化。PRV經(jīng)2 h吸附Vero細胞后改換維持液(此時計時為0 h)，2 h、4 h、6 h、8 h、12 h和24 h采樣。所有樣品經(jīng)蛋白濃度測定后等量樣品(20 μg)western blot分析。PRV感染Vero細胞4 h后開始檢測到gH蛋白，并隨著病毒感染時間的延長而增加；而內(nèi)參蛋白actin蛋白的量一致，表明總蛋白上樣量是一致的(圖5)。

3 討論

gH與gL是以異源二聚體的形式存在的兩種糖蛋白，其二聚體是一個功能單位，對病毒粒子和靶細胞間的融合及病毒在細胞間的傳遞是必需的，對介導(dǎo)病毒在神經(jīng)系統(tǒng)的傳播也起重要作用[5-6,10]，但其具體的作用機制和受體蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)仍需進一步研究。本研究以原核表達了PRV囊膜糖蛋白gH膜外區(qū)部分區(qū)域，純化的gH重組蛋白作為免疫原制備抗PRV gH抗體，并利用所制備的抗原和抗體進一步檢測了PRV感染細胞中g(shù)H蛋白，分析了gH蛋白時空表達，初步探討感染細胞中PRV的復(fù)制，為PRV與宿主相互作用的研究提供方法。

抗PRV-gH抗體和抗p53抗體分別是用帶His標(biāo)簽的gH和p53重組蛋白作為免疫原免疫動物制備的，本實驗以抗PRV-gH抗體和抗p53抗體分別檢測帶標(biāo)簽的gH和p53重組蛋白，結(jié)果表明抗PRV-gH抗體只與gH重組蛋白結(jié)合，抗p53抗體只與p53重組蛋白結(jié)合，表明6個組氨酸未影響所制備抗體的特異性，無交叉反應(yīng)。

gH蛋白是皰疹病毒中同源性僅次于gB蛋白的保守蛋白，重組蛋白經(jīng)純化后可以作為間接ELISA診斷抗原，為下一步建立ELISA抗體診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。重組蛋白免疫實驗動物制備多克隆抗體，western blot和IFA檢測結(jié)果表明所制備的抗PRV gH抗體能夠識別病毒gH蛋白，具有良好的特異性；IFA結(jié)果表明抗PRV-gH抗體可進一步用于共聚焦實驗分析gH蛋白更精確的亞細胞定位以及臨床樣品的免疫組化實驗，制備的抗原和抗體為臨床診斷和實驗室研究準(zhǔn)備了有效的工具。

保守蛋白gH為病毒復(fù)制的必需蛋白，參與病毒侵入靶細胞以及病毒釋放等過程，Barbara等用計算機輔助預(yù)測了PRV gH的兩個潛在多肽表位，并制備了相應(yīng)的多克隆抗體[9]。Western blot結(jié)果顯示，在病毒感染細胞檢測到分子量為95 ku的糖基化形式gH蛋白，而Barbara報道gH有兩種形式，分子量為76 ku、95 ku，前者為非糖基化的形式[9]，本研究制備的抗體并未檢測到76 ku大小的蛋白，這可能與所選基因的片段有關(guān)；病毒感染細胞4 h后PRV gH蛋白已開始合成，8 h后PRV gH蛋白大量合成，進一步說明PRV保守蛋白gH可以作為PRV復(fù)制的指示蛋白，通過檢測PRV不同感染時間gH蛋白的表達量和定位變化，作為研究工具指示PRV感染細胞中病毒的復(fù)制情況。

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