唐 穎，路義鑫，韓彩霞，李曉云，宋銘忻

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

華支睪吸蟲(chóng)(Clonorchis sinensis)屬于后睪科(Opisthorchiidae)支睪屬(Clonorchis)。華支睪吸蟲(chóng)病是由于其成蟲(chóng)寄生于人、貓、犬等動(dòng)物的肝臟、膽囊和膽管內(nèi)而引起的一種人獸共患寄生蟲(chóng)病。該病主要分布于東亞和東南亞地區(qū)[1-2]，我國(guó)的廣東、廣西、黑龍江和吉林等省區(qū)也是該病的高發(fā)區(qū)[3]。

目前，華支睪吸蟲(chóng)的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、流行病學(xué)和病原鑒定等方面，而對(duì)華枝睪吸蟲(chóng)的群體遺傳特征研究較少[4]。ITS序列存在于核糖體DNA(rDNA)中，它的進(jìn)化速度快而且長(zhǎng)度較小，協(xié)同進(jìn)化使該片段在基因組不同單元間相對(duì)保守，因而適合采用分子技術(shù)來(lái)探討科內(nèi)屬間及屬下種間的遺傳關(guān)系。本研究以采自東北7個(gè)不同地區(qū)的華支睪吸蟲(chóng)為研究對(duì)象，采用DNA序列分析方法對(duì)其ITS1基因的變異情況進(jìn)行研究，以期鑒定華支睪吸蟲(chóng)科內(nèi)屬間及屬下種間的遺傳關(guān)系，并為進(jìn)一步研究華支睪吸蟲(chóng)的起源、分類(lèi)以及后睪科吸蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蟲(chóng)株采自大慶、泰來(lái)地區(qū)的華支睪吸蟲(chóng)由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)寄生蟲(chóng)教研室惠贈(zèng)；采自賓縣、海倫、雙城、同江和長(zhǎng)春地區(qū)的華支睪吸蟲(chóng)由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)寄生蟲(chóng)教研室惠贈(zèng)，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為華支睪吸蟲(chóng)，并由本教研室保存。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自TIANEN公司；TaqDNA聚合酶、pMD18-T載體、EcoRⅠ和HindⅢ購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 目的基因的擴(kuò)增 取不同地區(qū)華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)各5條，按照DNA提取試劑盒說(shuō)明提取DNA，-20℃保存。參考GenBank登錄的韓國(guó)株華支睪吸蟲(chóng)(EU038128)ITS 5.8S和28S保守區(qū)序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增ITS1基因引物，上游引物為 5'-CCTGCGGAAGGATCATTAC-3'；下游引物為5'-ATCCACCGCTCAGAGTTGTAC-3'，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增條件為：95℃10 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72℃10 min。同時(shí)設(shè)不加DNA模板的陰性對(duì)照，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 ITS1基因的測(cè)序結(jié)果與序列分析 將純化的PCR產(chǎn)物連接于pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。篩選陽(yáng)性重組菌，抽提重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定(EcoRⅠ和HindⅢ)，重組質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。每個(gè)序列均經(jīng)過(guò)正反鏈雙向3次測(cè)定，以確保序列的準(zhǔn)確性。應(yīng)用DNAStar軟件將DNA序列載入ClustalW1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，應(yīng)用MEGA程序?qū)ο到y(tǒng)進(jìn)行初步進(jìn)化分析，將本實(shí)驗(yàn)蟲(chóng)體的ITS1序列與GenBank登錄的吸蟲(chóng)序列進(jìn)行比對(duì)，用ClustalW軟件進(jìn)行排序，采用Phylip繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 ITS1序列的PCR擴(kuò)增 賓縣、大慶、海倫、雙城、泰來(lái)、同江和長(zhǎng)春源的7株華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)ITS1基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，均可見(jiàn)約700 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期目的片段(699 bp，其中包括5.8S部分序列17 bp、ITS1全序列661 bp、28S部分序列21 bp)相符，并且無(wú)非特異性條帶。

2.2 各地區(qū)華支睪吸蟲(chóng)ITS1測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果表明，ITS1序列與預(yù)期結(jié)果一致。這7株華支睪吸蟲(chóng)ITS1序列擴(kuò)增片段的大小均為661 bp，并且各測(cè)序結(jié)果堿基變異均小于6 bp。以賓縣株序列作為參照對(duì)象，大慶株、海倫株、泰來(lái)株堿基突變均為T(mén)114A；海倫株、同江株堿基突變均為C293T；大慶株、海倫株、泰來(lái)株、同江株、長(zhǎng)春株堿基突變均為C339T，大慶株堿基突變?yōu)門(mén)461A，大慶株堿基突變C615T。

2.3 序列分析 將測(cè)序獲得的不同地區(qū)華支睪吸蟲(chóng)ITS1基因序列錄入GenBank中，這7個(gè)序列登錄號(hào)分別為：賓縣株(CsBX)HQ186253、大慶株(CsDQ)HQ186254、海倫株(CsHL)HQ186255、雙城株(CsSC)HQ186256、泰來(lái)株(CsTL)HQ186258、同江株(CsTJ)HQ186259和長(zhǎng)春株(CsCC)HQ186260。

經(jīng)DNAStar軟件和DANMAN軟件分析，ITS1序列的核苷酸同源性在99.4%～100%之間，遺傳距離在0～0.006之間，賓縣株與雙城株、海倫株與泰來(lái)株、同江株與長(zhǎng)春株序列核苷酸同源性均為100%。

將ITS1序列與GenBank登錄的吸蟲(chóng)序列進(jìn)行比對(duì)，用ClustalW軟件進(jìn)行排序，采用Phylip繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。

在吸蟲(chóng)的分類(lèi)過(guò)程中，傳統(tǒng)的分類(lèi)方法是以形態(tài)、生活史、流行病學(xué)等特征對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行鑒別分類(lèi)，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行，但受各種因素的影響，很難準(zhǔn)確的對(duì)吸蟲(chóng)進(jìn)行分類(lèi)。近年來(lái)，吸蟲(chóng)鑒別分類(lèi)以DNA序列分析方法最為常見(jiàn)，該方法可準(zhǔn)確地從基因水平上反應(yīng)蟲(chóng)種的遺傳信息，通過(guò)比較不同類(lèi)群個(gè)體同源核酸的核苷酸排列順序，研究樣品的遺傳變異水平[5]。在吸蟲(chóng)研究中，主要是通過(guò)核糖體和線(xiàn)粒體基因組中的部分序列進(jìn)行分析，了解吸蟲(chóng)種間和種內(nèi)遺傳變異情況，明確其分類(lèi)地位。

ITS1位于核糖體中18S與5.8S之間，從細(xì)菌、真菌到高等動(dòng)、植物的18S、5.8S、28S的序列都是高度保守的；ITS序列的進(jìn)化速度較快，而且在核基因組中是高度重復(fù)、而且不同ITS拷貝間的序列相近或完全一致，ITS的序列信息可以提供比較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)。林瑞慶等對(duì)片形吸蟲(chóng)ITS1序列進(jìn)行多態(tài)性研究結(jié)果顯示，ITS1序列可作為遺傳標(biāo)記用于區(qū)分大片吸蟲(chóng)和肝片吸蟲(chóng)[5]。李利等提出黑龍江大慶地區(qū)牛源、綿羊源、絨山羊源和山羊源土耳其斯坦東畢吸蟲(chóng)的線(xiàn)粒體ITS基因可用于土耳其斯坦東畢吸蟲(chóng)分類(lèi)及分子種系發(fā)生的研究[6]。

本研究通過(guò)對(duì)采自東北地區(qū)7個(gè)不同地域華支睪吸蟲(chóng)樣品進(jìn)行ITS1基因序列擴(kuò)增，均得到661 bp的序列，產(chǎn)生變異的堿基數(shù)均小于6，同源性在99.4%～100%之間，遺傳距離在0～0.006之間。用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示，分支情況與地區(qū)相隔遠(yuǎn)近成正相關(guān)，屬于同域遺傳，株特異性遺傳標(biāo)記，并沒(méi)有因?yàn)樯掣綦x而產(chǎn)生新的種群，沒(méi)有發(fā)生同域物種形成的情況，但有不同程度的分化。廣西株與其它區(qū)域華支睪吸蟲(chóng)所屬分支相隔較遠(yuǎn)，韓國(guó)株與東北8個(gè)株相隔較近，這可能與生態(tài)環(huán)境和地理環(huán)境有關(guān)。廣西屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，東北地區(qū)和韓國(guó)屬溫帶大陸性氣候。東北8個(gè)株自身差異較小，海倫株與泰來(lái)株，大慶株與沈陽(yáng)株，長(zhǎng)春株與同江株，雙城株與賓縣株位于同一分支。

本研究結(jié)果顯示，ITS1片段可作為遺傳標(biāo)記用以鑒定華支睪吸蟲(chóng)科內(nèi)屬間遺傳關(guān)系，還可以區(qū)分屬下種間的遺傳關(guān)系，本研究的結(jié)果對(duì)華支睪吸蟲(chóng)進(jìn)一步的分類(lèi)、鑒定、遺傳變異研究、防治等都具有重要意義。

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[3]全國(guó)人體重要寄生蟲(chóng)病現(xiàn)狀調(diào)查辦公室.全國(guó)人體重要寄生蟲(chóng)病現(xiàn)狀調(diào)查報(bào)告[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2005，23(5)增刊：332-340.

[4]Neil D,Young B E,Campbell D,et al.Unlocking the transcriptomes of two carcinogenic parasites,Clonorchis sinensisand Opisthorchis viverrini[J].PLoS Negl Trop Dis,2010.4(6):e719.

[5]林瑞慶，董世娟，胥楚雄，等.片形吸蟲(chóng)第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)DNA多態(tài)性的研究[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2004，34(7)：8-12.

[6]仇建華，李利，王春仁，等.牛羊源土耳其斯坦東畢吸蟲(chóng)ITS和28SrDNA-LSU序列分析[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2008，26(3)：183-186.