潘 偉，高玉龍，劉超男，秦立廷，王永強(qiáng)，祁小樂，高宏雷，王笑梅

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001)

J亞群禽白血病病毒(Subgroup J of avian leukosis virus，ALV-J)最初由Payne從肉用型雞中分離鑒定[1]，該病毒的前病毒基因組具有典型C型反轉(zhuǎn)錄病毒基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即 5'LTR、gag、pol、env、3'LTR。其中，不同病毒株間gag和pol基因非常保守，而env基因則發(fā)生了較大的變異[2-4]。env基因的變異主要出現(xiàn)gp85的編碼區(qū)。gp85蛋白的變異主要發(fā)生在第40 aa～70 aa、115 aa～120 aa、180 aa～220 aa等處。研究表明有些位點(diǎn)的改變可能導(dǎo)致疏水性顯著變化，從而引起抗原性發(fā)生顯著變化[5]。

2009年至2010年，我國部分地區(qū)蛋雞群中爆發(fā)J亞群禽白血病[6]，給我國蛋雞業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。為了解這些地區(qū)蛋雞ALV-J流行株的來源及進(jìn)化關(guān)系，本研究對2009年以來從國內(nèi)6個(gè)省區(qū)蛋雞場中分離到的19個(gè)ALV-J分離株的gp85基因進(jìn)行了克隆測序，并與其他來源的11株ALV-J作了比較分析。

1 材料和方法

1.1 病毒分離株 19個(gè)蛋雞ALV-J分離株均為本實(shí)驗(yàn)室于2009年～2010年間分離自我國部分地區(qū)(表1)。用于比對分析的其他病毒株序列來自Gen-Bank，分別為國際參考株4817(AF247385)、ADOL-7501(AY027920)、ADOL-Hc1(AF097731)、HPRS-103(Z46390)、國內(nèi)分離自海蘭灰蛋雞的參考病毒株SD07LK1(EU264064)、麻黃肉種雞株 SCAU-0901(FJ619190)與白羽肉雞的參考病毒株NX0101(AY897227)、HN0001(AY897219)、YZ9901(AY897222)、SD0002(AY897224)和 SD0101(AY897220)。

表1 蛋雞ALV-J分離株的地理分布及分離年代Table 1 The area distribution and isolated year of relative ALV-J isolates

1.2 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker和pMD18-T均購自TaKaRa公司；Plasmid Miniprep Kit和 DNA Gel Extraction Kit為AxyGen產(chǎn)品。

1.3 前病毒DNA的提取 將這19個(gè)ALV-J分離株分別感染后檢測為陽性的DF-1細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后，分別取100 μL細(xì)胞上清，按照常規(guī)方法提取DNA：取病料研磨液100 μL，加入裂解液裂解后，靜止5 min～10 min；酚/氯仿/異戊醇抽提，RNA酶消化后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 gp85基因的克隆和測序 以ALV-J原型株HPRS-103為參考株(Z46390)，設(shè)計(jì)合成用于擴(kuò)增各病毒株gp85基因的引物。上游引物為：5'-GGAGTT CATCTATTGCAACAACC-3'；下游引物為：5'-GCG CCTGCTACGGTGGT-3'，引物由上海Invitrogen公司合成。預(yù)期擴(kuò)增片段長度為924 bp。參照ExTaq試劑反應(yīng)體系對該病毒株gp85基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收后克隆入pMD18-T中，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)、篩選和鑒定，每個(gè)片段選3個(gè)以上陽性克隆由上海Invitrogen公司測序。

1.5 序列分析 采用DNAStar中SeqMan軟件對測序結(jié)果進(jìn)行剪輯、拼接，并將各ALV-Jgp85基因序列與GenBank中的11株ALV-J序列進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 各分離株gp85基因的PCR結(jié)果 以各ALV-J病毒株感染DF-1細(xì)胞，以提取細(xì)胞基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，結(jié)果擴(kuò)增出了約900 bp特異性條帶，與已知陽性對照組HPRS-103的PCR結(jié)果一致。而對照DF-1細(xì)胞提取的基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果為陰性(圖 1)。

2.2 各分離株gp85推導(dǎo)氨基酸序列與參考病毒株的同源性比較 19個(gè)蛋雞ALV-J分離株的gp85基因ORF全長不等，為894 bp～924 bp，分別編碼298～308個(gè)氨基酸，其推導(dǎo)氨基酸序列同源性為80.9%～100%。其中，A組(HB09JY04株、HLJ09MDJ-1株與 SD09WF03株)間以及 B組間(JL09DHS8株、JL09JL2-1株與JL0904株)氨基酸序列同源性均達(dá)到100%，表明它們可能分別源自同一病毒株。而JL09DH02株與其他分離株的同源性僅為80.9%～88.3%，表明該病毒株gp85基因發(fā)生了較大變異。gp85基因比較表明，不同地區(qū)流行株不存在地域性差異，而是許多病毒株的混合感染，給該病的診斷和防制帶來很大困難。

將19個(gè)分離株與4株國際參考株(HPRS-103、ADOL-7501、4817、ADOL-Hcl)的gp85基因氨基酸同源性進(jìn)行比較分析結(jié)果表明，它們與4株國際參考株之間的同源性平均為83.4%(68.7%～98.1%)。其中，這19個(gè)分離株與原型株HPRS-103的同源性最高，平均為87.0%(75.9%～98.1%)，與美國肉雞株ADOL-7501的平均同源性最低，僅為75.0%(68.7%～87.3%)。這些數(shù)據(jù)表明，19個(gè)分離株gp85基因發(fā)生了較大變異，但相對美國ALV-J株，這些病毒株與HPRS-103株親緣關(guān)系更近。

19個(gè)分離株與來自白羽肉雞的5株國內(nèi)參考株gp85氨基酸同源性平均為83.2%(71.9%～94.5%)。其中，19個(gè)分離株與SD0002、SD0101的同源性最高，平均為83.1%(71.9%～94.2%)，而與NX0101的同源性最低，平均為81.8%(730%～90.6%)。這提示目前蛋雞ALV-J分離株與國內(nèi)肉雞分離株gp85基因存在差異。

而19個(gè)分離株與來自國內(nèi)早期蛋雞的SD07LK1株同源性平均為 82.1%(72.6%～91.6%)。這表明，雖然同是國內(nèi)蛋雞分離株，但這19株蛋雞分離株ALV-Jgp85基因卻與國內(nèi)早期蛋雞ALV-J存在很大的差異。

2.3 各分離株gp85推導(dǎo)氨基酸與參考病毒株的遺傳進(jìn)化樹分析 采用DNAStar MegAlign繪制遺傳進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果顯示，本研究中19個(gè)分離株在進(jìn)化樹中大致可歸類為3個(gè)分支。其中，HB09XZ01株、SD09TA04株、HB09JY03株、SD09WF03株、GD09FS05株、SD09JY04株、SD09WF01株、HB09JY04株、HLJ09MDJ-1株、JL09DHS8株、JL09JL2-1株、JL0904株、HB09XT02株與原型株HPRS-103親緣關(guān)系較近，并且SD09TA02株與HPRS-103株的親緣關(guān)系最近。此外，這13個(gè)分離株也與國內(nèi)分離自麻黃肉種雞株SCAU-0901屬于同一分支，表明它們與SCAU-0901株的關(guān)系較近。

SD09DP03、SD09DP04、HLJ09BL株則與美國株ADOL-7501株、國內(nèi)肉雞中分離的HN0001株的親緣關(guān)系較近。而JL0903、HF0812、JL09DH02株則處在獨(dú)立分支，表明它們的gp85基因發(fā)生了很大變異。

值得注意的是，各分離株與美國白羽肉雞中分離的ADOL-Hcl、4817、國內(nèi)早期白羽肉雞株NX0101、SD0101、YZ9901、SD0002及蛋雞株SD07LK1株處在不同分支，表明它們之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，提示國內(nèi)當(dāng)前蛋雞株可能并非源自國內(nèi)早期肉雞株，其來源有待進(jìn)一步研究。

本研究表明，從gp85基因方面分析，我國部分省區(qū)蛋雞群中ALV-J流行株大多與英國原型株HPRS-103親緣關(guān)系較近，但其同源性相比早期病毒株已經(jīng)有所降低。更多變異病毒株出現(xiàn)在蛋雞群中，而變異病毒株對蛋雞致病性是否發(fā)生改變則應(yīng)引起高度重視。

[1]Payne L N,Brown S R,Bumsted N,et al.A novel subgroup of exogenous avian leucosis virus in chickens[J].J Gen Virol,1991,72(4):801-807.

[2]杜巖，崔治中，秦愛建，等.雞的J亞群白血病病毒的分離及部分序列分析[J].病毒學(xué)報(bào)，2000，4：341-346.

[3]劉超男，高玉龍，高宏雷，等.J亞群與E亞群禽白血病自然重組病毒的全基因組序列分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31(12)：978-981.

[4]Venugoal K,Smith L M,Howes K,et al.Antigenic variants of J subgroup avian leucosis virus:sequence analysis reveals multiple changes inenvgene[J].J Gen Virol,1998,79:757-766.

[5]Silva R F,Fadly A M,Hunt H D.Hypervariability in the envelope gene of subgroup J avian leucosis virus obtained from different farms in the United States[J].Viology,2000,272:106-111.

[6]高玉龍，邵華斌，羅青平，等.2009年我國部分地區(qū)禽白血病分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32(1)：32-35.