李 冰，褚現(xiàn)明，高美華，徐穎婕

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院1.生物學(xué)教研室，山東 青島 266021;2.附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山東 青島 266101;3.免疫學(xué)教研室，山東青島 266021)

光動力學(xué)療法是一種微創(chuàng)性治療手段［1－2］。隨著光敏物質(zhì)、光激活裝置和導(dǎo)光系統(tǒng)的發(fā)展和進(jìn)步，該療法已逐步成為腫瘤的基本治療手段之一。光動力學(xué)療法的治癌機(jī)制主要是由于癌細(xì)胞能特異性攝取一種叫光敏劑的物質(zhì)。光敏劑被癌細(xì)胞攝取后，能較長時間留在癌細(xì)胞內(nèi)。光敏劑經(jīng)一種特殊波長的光(常用630nm的激光)照射后，產(chǎn)生一種具有毒性作用的活性態(tài)氧離子，從而破壞癌細(xì)胞。所以光敏劑的選擇至關(guān)重要，目前選擇開發(fā)安全無毒的新型光敏劑成為研究的重點［3－4］。

藻藍(lán)蛋白(C-phycocyanin，C-PC)是一種存在于鈍頂螺旋藻細(xì)胞內(nèi)的光合色素，能高效捕獲光能。由肽鏈上共價結(jié)合1個開鏈的四吡咯環(huán)輔基構(gòu)成，類似動物紅細(xì)胞的血紅素結(jié)構(gòu)。因其水溶性、安全無毒、清亮且著色力強等優(yōu)點，藻藍(lán)蛋白被廣泛用于食品著色劑和化妝品的添加劑。另外藻藍(lán)蛋白具有一定的醫(yī)療價值，具有改善血脂代謝、抗衰老、抗氧化、抗輻射、抗疲勞、抑制腫瘤和提高機(jī)體免疫力等作用［5］。蔡心涵等［6］用螺旋藻藻藍(lán)蛋白對 S180移植瘤和人大腸癌細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)外激光治癌實驗，但對作用機(jī)制研究甚少，本研究選擇藻藍(lán)蛋白作為光敏劑，對其介導(dǎo)的光動力學(xué)療法治療小鼠乳腺癌的免疫和凋亡機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料

1.1 實驗動物BALB/C純系小鼠40只，♀♂各半，體質(zhì)量20～22 g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物房。

1.2 細(xì)胞MCF-7細(xì)胞(本實驗室保種)。

1.3 激光器HNZSQ-型氦氖激光照射器(上海醫(yī)用激光儀器廠)

1.4 光敏劑藻藍(lán)蛋白。由本實驗室從鈍頂螺旋藻粉中提取純化，純度為A620/A280=4.71。

1.5 其它試劑4%多聚甲醛(PFA)、3%檸檬酸、2×SSC、DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司);胰酶(購自Amersco公司);Poly-L-Lysine、DEPC、CD44 原位雜交試劑盒、Fas免疫組化試劑盒、兔抗人P53/NFkB單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

2 方法

2.1 動物模型建立和分組小鼠在左側(cè)肋緣皮下脾區(qū)接種MCF-7細(xì)胞0.2 ml(約1×105個細(xì)胞)，24 h后隨機(jī)分成3組:(1)對照組:15只小鼠，植瘤后不照激光不加藻藍(lán)蛋白;(2)激光照射組:15只小鼠，植瘤24 h后進(jìn)行He-Ne激光照射;(3)藻藍(lán)蛋白處理組:15只小鼠，注入2ml藻藍(lán)蛋白液(320 g·L－1);(4)藻藍(lán)蛋白+激光照射組:15只小鼠，注射2ml藻藍(lán)蛋白液(320 g·L－1)，2 h后給予激光照射。

照射時需固定小鼠，去毛并充分暴露瘤體，采用24 mW He-Ne激光照射器照射瘤區(qū)，激光光纖輸出電流10 mA，光纖頭距離瘤體中心50 cm，光斑直徑2 cm，每天照射10 min，照射10 d為一療程。

2.2 組織的采集、石蠟包埋和切片的制作

2.2.1 組織的收集和處理 4～5 d長出腫塊，實驗d11乙醚麻醉小鼠后斷頸處死，置于75%乙醇溶液中消毒5 min。剖開小鼠腹腔取出胸腺和脾臟，并分離皮內(nèi)瘤塊，將以上組織去除包膜，稱瘤塊重量并計算每組小鼠的腫瘤形成率(成瘤率/%=每組中有腫瘤形成的小鼠數(shù)量/每組小鼠的數(shù)量×100%)。

取腫瘤組織切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，分別置于盛有10%甲醛(DEPC處理)的小瓶中，4℃固定。余下組織經(jīng)針?biāo)ㄑ心ィ?00目篩絹過濾，制成細(xì)胞懸液。

2.2.2 載玻片、器皿和儀器的處理 配制1∶10的多聚賴氨酸于塑料容器中，每批載玻片泡5 min。所有載玻片、器皿和儀器均需浸泡在DEPC中做除RNA酶處理。

2.2.3 常規(guī)石蠟切片的制備

2.3 免疫細(xì)胞免疫活性的監(jiān)測

2.3.1 各組中NK細(xì)胞活性的比較 取脾細(xì)胞5×106作為效應(yīng)細(xì)胞(NK細(xì)胞)，K562細(xì)胞5×105(靶細(xì)胞)，效 ∶靶為10 ∶1。取效、靶細(xì)胞各100 μl加入96 孔板，各孔加 MTT 10 μl(5 g·L－1)，置 37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育 4 h，離心 1500 r·min－1，吸去上清，每孔加入二甲基亞砜150 μl，振蕩10 min，570 nm波長測OD值。NK活性/%=［實驗孔(效靶)OD值－效應(yīng)細(xì)胞孔OD值］/靶細(xì)胞對照孔OD值×100%。

2.3.2 各組中T細(xì)胞增殖活性比較 采用MTT還原分析法。將胸腺制成細(xì)胞懸液，用RPMI 1640營養(yǎng)液洗3 次，將細(xì)胞配成5 ×109·L－1，取100 μl(含5×105/細(xì)胞)細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入ConA 20 μl(濃度 25 mg·L－1)，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收獲前 5 h 參入 MTT 50 μg·孔－1，培養(yǎng)結(jié)束時，低溫離心1 000 r·min－1，棄上清，加入二甲亞砜150 μl，振蕩10 min，490 nm 處測 OD 值，作為T細(xì)胞的增殖活性。

2.4 免疫組化法檢測各組中腫瘤細(xì)胞表面Fas、NF-κB、p53蛋白表達(dá)的比較實驗步驟按試劑說明書。切片常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，熱修復(fù)抗原，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明，中性樹膠封片。免疫組化染色胞質(zhì)或(和)胞膜棕黃色為陽性結(jié)果。參照Frormowitz的方法，隨機(jī)選取5個高倍視野(×400)，首先根據(jù)陽性細(xì)胞所占的百分比記分，陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，76% ～100%為4分。再根據(jù)陽性細(xì)胞顯色強度記分:無著色為0分，輕度色為1分，中度染色為2分，重度染色為3分，兩者得分之和即為陽性蛋白表達(dá)，其中0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性()，6～7分為強陽性()。

2.5 原位核酸雜交法檢測各組中腫瘤細(xì)胞CD44mRNA表達(dá)的比較具體步驟參照CD44原位雜交試劑盒說明書進(jìn)行。由上海博亞生物公司合成針對CD59cDNA的寡核苷酸探針。探針序列為5'-AAGTGTTGGAAGCATGAGCAGTGCAATT-3'，5'經(jīng)地高辛標(biāo)記。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性酶，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，充分水洗。乙醇脫水，二甲苯透明，封片，鏡檢。

2.6 MCF-7細(xì)胞增殖活性檢測采用 MTT法。將MCF-7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用RPMI 1640營養(yǎng)液洗3 次，將細(xì)胞配成5 ×108·L－1，取100 μl加入96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞分成4組:對照組，激光照射組(細(xì)胞每天接受激光照射2 min)，藻藍(lán)蛋白處理組(加入80 mg·L－1的藻藍(lán)蛋白液)，光動力學(xué)治療組(加入80 mg·L－1的藻藍(lán)蛋白液兩小時后激光照射2 min)。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收獲前5 h加入20 μl/孔 MTT(5 g·L－1)，培養(yǎng)結(jié)束時，低溫離心1 000 r·min－1，棄上清，加入二甲亞砜100 μl/孔，輕微振蕩10 min使甲臜結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測定490 nm處的光密度(OD490)。

2.7 電鏡形態(tài)學(xué)觀察不同組的MCF-7細(xì)胞分別收集于EP管中，PBS洗滌兩次。1500 r·min－14℃離心10 min，細(xì)胞沉淀用PBS洗兩次，將細(xì)胞懸浮于2.5%戊二醛中固定30 min，再用PBS洗兩次、將細(xì)胞懸浮于1%鋨酸中固定1 h、以丙酮梯度脫水、在將細(xì)胞置于丙酮∶包埋劑(1∶1)中置換30 min、用單包埋劑浸泡2 h，離心收集細(xì)胞，按常規(guī)將細(xì)胞包埋、切片、雙重染色，用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.8 細(xì)胞色素C釋放試驗分別取4組細(xì)胞少量置于EP管中，pH7.4 0.01 mol·L－1PBS洗滌兩次。細(xì)胞涂片，吹干。95%乙醇固定5 min，待干加入FITC-抗人細(xì)胞色素C約每孔5 μl，對照孔加小鼠IgG 約5 μl，置濕盒中，37℃ 45 min。PBS 洗滌3 次，干后鏡檢。陰性對照組，用PBS代替一抗。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果以±s表示，以SPSS軟件分析，t檢驗確定差異顯著性。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠瘤塊重量和腫瘤形成率的比較Tab 1和Fig 1、2顯示，與對照組相比較，激光組中瘤塊體積、重量和腫瘤形成率無變化(P＞0.05)，而藻藍(lán)蛋白處理組中明顯降低(P＜0.05)，PDT組與對照組比較，差異有顯著性(P＜0.01)。PDT組與藻藍(lán)蛋白處理組比較，P＜0.05。這說明CPC具有抗腫瘤的作用，而在輔助He-Ne激光作用后，這種作用效果更加明顯。

3.2 各組中NK細(xì)胞活性比較由Tab 2可見，與對照組相比，單獨激光照射對NK細(xì)胞活性影響不大(P＞0.05)，而C-PC具有增強NK細(xì)胞活性的作用，與對照組相比較，P＜0.05，差異有顯著性。而PDT組與對照組比較，差異有顯著性(P＜0.01)。PDT組與藻藍(lán)蛋白處理組比較，P＜0.05。這表明激光能夠增強藻藍(lán)蛋白對NK細(xì)胞的活化作用。

3.3 各組小鼠T細(xì)胞增殖活性的比較Fig 3表明，與對照組相比，He-Ne激光照射組無明顯變化(P＞0.05)。而藻藍(lán)蛋白處理組中荷瘤小鼠胸腺T細(xì)胞增殖活性明顯增強，與對照組相比，P＜0.05，差異明顯。而光動力學(xué)治療組差異更為顯著，P＜0.01。PDT組與藻藍(lán)蛋白處理組比較，P＜0.05。由此證明CPC具有增強T細(xì)胞活性的功能，而激光可強化這一功能。

Tab 1 Comparision of tumor weight of four groups of mice

Fig 1 Comparision of tumor volume of four groups of mice

Fig 2 Comparision of tumor forming rate of four groups of mice

Tab 2 Comparision of NK cell activities of four groups of mice(n=15)

Fig 3 Comparision of the proliferative activity of T cells of four groups of mice

3.4 各組中腫瘤細(xì)胞Fas基因表達(dá)的比較Tab 3顯示，激光照射組腫瘤細(xì)胞中Fas蛋白的陽性表達(dá)率為53.33%，與對照組差異無顯著性(P＞0.05)，而藻藍(lán)蛋白處理組明顯高于對照組(66.67%)，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。而PDT組中Fas的陽性表達(dá)率為80%，明顯高于其在其它3組中的表達(dá)，P＜0.01。Fig 3顯示藻藍(lán)蛋白處理組腫瘤組織中Fas的陽性表達(dá)量明顯高于對照組，而光動力學(xué)治療組腫瘤細(xì)胞中Fas的陽性表達(dá)量較其它3組中的表達(dá)又進(jìn)一步升高。這表明藻藍(lán)蛋白對腫瘤組織中Fas的表達(dá)具有促進(jìn)作用，而輔助激光照射能使促進(jìn)作用更明顯。

Tab 3 Comparision of Fas protein expression in tumor cells of four groups of mice(n=15)

Fig 4 Comparision of Fas protein expression in tumor cells of four groups of mice

3.5 各組中腫瘤細(xì)胞中NF-κB和p53蛋白表達(dá)的比較Tab 4顯示，與對照組相比，激光照射組腫瘤組織中NF-κB和p53的陽性表達(dá)率無明顯變化(P＞0.05)。而藻藍(lán)蛋白處理組腫瘤組織中NF-κB和p53的陽性表達(dá)率分別為73.33%和80%，明顯低于它們在對照組中的表達(dá)(93.33%)，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。而PDT組中NF-κB和p53的陽性表達(dá)率為53.33%和60%，明顯低于其在其它3組中的表達(dá)(P＜0.01)。這表明藻藍(lán)蛋白具有抑制腫瘤組織中NF-κB和p53表達(dá)的作用，而激光照射能增強這種抑制作用。

3.6 各組中腫瘤細(xì)胞CD44 mRNA表達(dá)的比較Tab 5顯示，激光照射組腫瘤細(xì)胞中CD44 mRNA的陽性表達(dá)率86.67%，與對照組相比無明顯變化(P＞0.05)，而藻藍(lán)蛋白處理組為78.57%，明顯低于它在對照組中的表達(dá)(93.75%)，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。而PDT組中CD44 mRNA的陽性表達(dá)率為60%，明顯低于其在其它3組中的表達(dá)(P＜0.05)。由Fig 4可見，藻藍(lán)蛋白處理組腫瘤組織中CD44 mRNA的陽性表達(dá)量明顯低于對照組，而光動力學(xué)治療組腫瘤細(xì)胞中CD44 mRNA的陽性表達(dá)量較其在對照組和激光照射組中的表達(dá)又進(jìn)一步下降。這表明藻藍(lán)蛋白具有抑制腫瘤組織中CD44 mRNA表達(dá)的作用，而在激光照射的輔助下該抑制作用得到進(jìn)一步提升，從而抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及其侵襲轉(zhuǎn)移能力。

Tab 4 Comparision of NF-κB，p53 protein expression in tumor cells of four groups of mice

Tab 5 Comparision of CD44 mRNA expression in tumor cells of four groups of mice(n=15)

Fig 5 Comparision of CD44 mRNA expression in tumor cells of four groups of mice

3.7 MCF-7細(xì)胞增殖活性檢測Fig 6表明，與對照組相比，He-Ne激光照射組MCF-7細(xì)胞數(shù)目無明顯變化(P＞0.05)。而藻藍(lán)蛋白處理組中MCF-7細(xì)胞數(shù)目明顯減少，與對照組相比(P＜0.05)，差異明顯。而光動力學(xué)治療組差異更為明顯(P＜0.01)。由此證明藻藍(lán)蛋白具有抑制MCF-7細(xì)胞增殖的功能，而激光可強化這一功能。

Fig 6 Detection of proliferative activities of MCF-7 cells

3.8 電鏡形態(tài)學(xué)觀察Fig 7顯示藻藍(lán)蛋白處理組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了一系列的改變，細(xì)胞失去微絨毛，胞質(zhì)濃縮，核染色質(zhì)凝集，而光動力學(xué)治療組細(xì)胞變圓，染色質(zhì)進(jìn)一步凝集，該結(jié)果說明藻藍(lán)蛋白可能通過誘導(dǎo)體外 MCF-7細(xì)胞的凋亡來發(fā)揮其抗腫瘤效用，而結(jié)合激光作用后可加速細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。

Fig 7 Morphological features of three groups of MCF-7 cells

3.9 細(xì)胞色素C釋放試驗Fig 8表明，與對照組相比，He-Ne激光照射組MCF-7細(xì)胞內(nèi)熒光強度無明顯變化。而藻藍(lán)蛋白處理組中MCF-7細(xì)胞中熒光強度明顯增強，而光動力學(xué)治療組中熒光強度進(jìn)一步增強。由此證明藻藍(lán)蛋白具有促進(jìn)MCF-7細(xì)胞中細(xì)胞色素C從線粒體向細(xì)胞質(zhì)的釋放，而激光可強化這一功能。

4 討論

Fig 8 Comparision of release quantities of cytochrome C

腫瘤的形成是一種多因素、多階段、長期相互作用的過程，其機(jī)制非常復(fù)雜。近年來，有關(guān)分子腫瘤學(xué)的研究進(jìn)展極為迅速，癌基因、原癌基因、抗癌基因的異常表達(dá)，造成腫瘤細(xì)胞死亡信號傳遞系統(tǒng)的紊亂可能是腫瘤形成的重要機(jī)制［7－11］。本研究選用對人無害的氦氖激光照射瘤細(xì)胞區(qū)，促進(jìn)腫瘤死亡信號的傳遞，并提高荷瘤機(jī)體的抗腫瘤免疫力。研究結(jié)果證明:藻藍(lán)蛋白處理組瘤塊重量、腫瘤形成率均低于對照組，同時，藻藍(lán)蛋白能夠增強NK細(xì)胞的活性及T細(xì)胞的增殖活性，這表明藻藍(lán)蛋白照射確實具有抗腫瘤及提高免疫細(xì)胞活性的作用。而藻藍(lán)蛋白和激光聯(lián)合作用后，抗腫瘤免疫效應(yīng)明顯增強，藻藍(lán)蛋白的光敏作用可能與藻藍(lán)蛋白的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。藻藍(lán)蛋白屬于藻膽蛋白的一種，為一種捕光色素蛋白，具光能作用，它的載體蛋白以共價鍵形式連結(jié)著開鏈血毗咯發(fā)色團(tuán)，與卟啉衍生物有類似之處。目前我國應(yīng)用的光敏劑多數(shù)為血卟啉衍生物，如YHPD、癌光啉等，或葉綠素葉啉，這些光敏劑在臨床上應(yīng)用時，往往存在一定的毒副作用，在治療時，患者為防止正常組織及皮膚受損而需避光一段時間，使激光治癌受到一定的限制。而藻藍(lán)蛋白從海洋生物藻藍(lán)中提取，資源豐富，且其無毒，安全，其本身已作為營養(yǎng)保鍵食品為人們利用，故這種光敏劑如能用于臨床，病人更易接受，具有進(jìn)一步推廣應(yīng)用價值。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生作為光動力學(xué)療法治療癌癥、誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的機(jī)制性探討也在本實驗中得到了證實。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞受基因調(diào)控的程序性的死亡過程，F(xiàn)as、p53、NF-κB 是調(diào)控細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因，是細(xì)胞凋亡途徑中重要的信號分子［12－15］。免疫細(xì)胞上的配體FasL與Fas結(jié)合，通過激活caspase引起細(xì)胞凋亡。p53作為抑癌基因可通過控制細(xì)胞周期G1向S期移行來參與細(xì)胞周期調(diào)控。近年來發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子 κB(Nuclear factor-kappa b，NF-κB)的激活可以促進(jìn)腫瘤的生長，在腫瘤的治療中是研究的熱點，在腫瘤細(xì)胞中其具有調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的能力，與腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系密切，還能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡和免疫活性［16］。CD44及其變異體分子參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移，尤其是CD44V6在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，它們可能是判斷腫瘤生物學(xué)行為及預(yù)后因素的重要指標(biāo)［17－18］。藻藍(lán)蛋白處理后腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗凋亡基因(p53)和與腫瘤增殖轉(zhuǎn)移逃逸有關(guān)的基因(NF-κB、CD44)表達(dá)量明顯減少，而促凋亡基因(Fas)明顯增多。體外實驗也證實PDF組出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)，MCF-7的增殖活性受到抑制，而細(xì)胞色素C的釋放量明顯增多。在藻藍(lán)蛋白和氦氖激光聯(lián)合作用的光動力學(xué)治療組中p53、NF-κB、CD44蛋白的表達(dá)量進(jìn)一步增多，而Fas大大減少。MCF-7細(xì)胞的凋亡形態(tài)更為明顯，增殖活性進(jìn)一步降低，而細(xì)胞色素C的釋放量進(jìn)一步增多。

本實驗證明藻藍(lán)蛋白可以作為一種光敏劑，其介導(dǎo)的光動力學(xué)療法在宮頸癌治療中的作用機(jī)制主要是通過增強機(jī)體的免疫力，同時啟動MCF-7細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到殺死腫瘤的目的。

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