劉 義，吳昆鵬，楊巧珠，李延平，崔 燎

(1.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.廣東醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，廣東湛江 524023)

小分子肽(KP)是應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室的中國(guó)發(fā)明專利技術(shù)(公開號(hào):CN101015580)制備得到的一種小分子多肽，其相對(duì)分子質(zhì)量為189～512u，具有水溶性強(qiáng)、生物活性強(qiáng)、結(jié)腸吸收率高的等特點(diǎn)［1］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示KP能很好地預(yù)防骨質(zhì)疏松［2］，但其作用機(jī)制還不明確。骨質(zhì)疏松癥防治藥物臨床前有效作用研究，除需骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型作藥效評(píng)價(jià)外，還需包含對(duì)成骨細(xì)胞形成促進(jìn)有效或?qū)ζ乒羌?xì)胞吸收抑制有效的藥效研究［3］，而NF-κB信號(hào)通路在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)以小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1為研究對(duì)象，通過(guò)多個(gè)指標(biāo)來(lái)衡量KP對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化的影響，并結(jié)合NF-κB表達(dá)的變化，初步探討KP在發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松中促成骨作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(HERAcell 150i，USA)，ELX800 酶標(biāo)儀 (Bio-tek instruments Inc，USA)，Milli Q A10 超純水器(Millipore Inc，USA)，恒溫水浴鍋(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)，55P 72超速離心機(jī)(日本日立公司)，恒溫震蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)儀器廠)，DHG 9036A干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器廠)，垂直板電泳儀(北京六一廠)，轉(zhuǎn)移電泳槽(美國(guó)伯樂(lè))。

1.2 藥物和制劑KP由廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，胎牛血清(杭州四季青公司)，總蛋白提取試劑盒、Bradford蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(BestBio)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、上樣緩沖液、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(碧云天生物技術(shù)研究所)，小鼠抗NF-κB p50、p60單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗(Santa Cruz)，Dulbeccos modified Eagles medium培養(yǎng)基(DMEM，Gibco-BRL)，對(duì)硝基苯磷酸二鈉、噻唑藍(lán)、胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉、茜素紅均為Sigma公司產(chǎn)品，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)蘇后，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%二氧化碳及飽和濕度條件下培養(yǎng)。每3天更換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用0.25%胰酶消化后傳代。

1.3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 調(diào)整細(xì)胞密度為5×108·L－1，接種于 96 孔板，每孔 100 μl，24 h 后，換含不同濃度KP的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，藥物濃度分別為0.01、0.1、1、10、25、50、100 mg·L－1，對(duì)照組為不含KP的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)8個(gè)重復(fù)孔。繼續(xù)孵育24、48、72 h，于細(xì)胞培養(yǎng)終止前每孔加入MTT(5 g·L－1)，孵育4 h后。吸出孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩 20 min，在570 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各組吸光度(OD值)。

1.3.3 PNPP法檢測(cè)細(xì)胞中堿性磷酸酶的活性 調(diào)整細(xì)胞密度為5×108·L－1，接種于96孔板，每孔100 μl，24 h后，換含不同濃度KP的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，藥物濃度分別為 0.01、0.1、1、10、25、50、100 mg·L－1，對(duì)照組為不含KP的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)8個(gè)重復(fù)孔，藥物作用 9、12、15、18 d后，去除培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，然后每孔加入150 μl PNPP反應(yīng)液(含有 25 mmol·L－1乙二醇胺、1 mmol·L－1氯化鎂和 6.7 mmol·L－1PNPP)。37℃避光孵育0.5 h后每孔加入100 μl的 0.1 mg·L－1氫氧化鈉終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1.3.4 紫外分光光度法檢測(cè)細(xì)胞中羥脯氨酸的含量 細(xì)胞按1×108·L－1接種于24孔板，每孔1 ml。24 h后，換含不同濃度KP的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，藥物濃度分別為0.01、0.1、1、10、25、50、100 mg·L－1，對(duì)照組為不含KP的DMEM培養(yǎng)液，每3天換培養(yǎng)液并加藥，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，藥物作用12、24 d后，去掉培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，每孔加入濃度為150 g·L－1的三氯醋酸 1 ml，4℃放置 18 h，然后收集細(xì)胞于1.5 ml的Eppendoff管中，500×g離心5 min，去除上清液，沉淀用 6 mol·L－1的鹽酸在110℃水解24 h，揮干鹽酸后用三蒸水復(fù)溶，按照羥脯氨酸測(cè)定試劑盒說(shuō)明書的要求操作，測(cè)定羥脯氨酸含量。

1.3.5 Alizarin red染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié) 調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×108·L－1，接種于 24 孔板，每孔 1 ml，24 h后，換含不同濃度KP的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，藥物濃度分別為50、100 mg·L－1，對(duì)照組為不含 KP的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。藥物作用30 d后，吸去培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，經(jīng)0.04甲醛于室溫下固定15 min，再用雙蒸水沖洗2遍，加入的茜素紅染色液，室溫孵育20 min并輕微振蕩，吸棄未結(jié)合的染料，用雙蒸水漂洗并振蕩5 min，重復(fù)4次，傾斜放置2 min，吸棄多余的雙蒸水，倒置顯微鏡觀察拍照記錄。

1.3.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中 NF-κB p65、p50 的表達(dá) 調(diào)整細(xì)胞密度為5×108·L－1，接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后，換含不同濃度KP的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，藥物濃度分別為 50、100 mg·L－1，對(duì)照組為空白的DMEM培養(yǎng)液。孵育 3、12、24、30 d。提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量，用β-actin做內(nèi)參，SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離蛋白，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后分別先加p65、p50抗體，二抗孵育后再加辣根過(guò)氧化物酶顯色，然后在暗室中加ECL進(jìn)行X線膠片曝光，再描測(cè)灰度值。

2 結(jié)果

2.1 KP對(duì)MC3T32-E1細(xì)胞增殖的影響各濃度KP對(duì)MC3T32-E1增殖無(wú)明顯地抑制作用，25、50、100 mg·L－1KP 作用 MC3T32-E1 細(xì)胞 24、48、72 h后均能促進(jìn)其增殖(P＜0.01)，結(jié)果如Fig 1。

Fig 1 The effect of KP on the cell growth of MC3T3-E1( ± s，n=8)

2.2 KP對(duì)MC3T32-E1細(xì)胞堿性磷酸酶的影響結(jié)果如 Fig 2:100 mg·L－1KP 在作用細(xì)胞 9、12、15 d后，能提高 MC3T32-E1細(xì)胞 ALP活性(P＜0.01);50 mg·L－1KP僅在9、12 d表現(xiàn)出此項(xiàng)作用(P ＜ 0.01);其他濃度(0.01、0.1、1、10、25 mg·L－1)均無(wú)增高M(jìn)C3T32-E1細(xì)胞ALP活性的作用。

Fig 2 The effect of KP on the ALP activity of MC3T3-E1( ± s，n=8)

2.3 KP對(duì)MC3T32-E1細(xì)胞羥脯氨酸活性的影響不同濃度的KP作用于MC3T32-E1細(xì)胞12、24 d后，結(jié)果(Fig 3)顯示 50、100 mg·L－1KP 能提高細(xì)胞中羥脯氨酸的含量(P＜0.01);其他濃度(0.01、0.1、1、10、25 mg·L－1)均無(wú)此作用，但也無(wú)減少其含量的作用。

Fig 3 The effect of KP on hydroxyproline content of MC3T3-E1(±s，n=6)

2.4 KP對(duì)MC3T32-E1細(xì)胞礦化作用的影響A-lizarin red染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)結(jié)果如Fig 4顯示:KP作用于MC3T3-E1 30 d后，與空白組比較，50、100 mg·L－1KP能明顯促進(jìn)MC3T32-E1的礦化，骨結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多，并與劑量成正比。

Fig 4 Photographs of 30-day bone nodules in KP-treated cultures of MC3T3-E1 cells(×200)

2.5 KP 對(duì) MC3T32-E1 細(xì)胞中 NF-κB p65、p50表達(dá)的影響50、100 mg·L－1KP 在 3、12、24、30 d均能不同程度地抑制 MC3T32-E1中 NF-κB p65、p50蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，見Fig 5。

3 討論

小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞株具有體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的各種生物學(xué)特性，是一株良好的體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞株，已成為國(guó)內(nèi)外公認(rèn)研究藥物對(duì)成骨細(xì)胞影響有價(jià)值的體外細(xì)胞型［4－5］。我們以前的研究顯示KP能明顯增加去卵巢大鼠的骨鈣含量，使骨密度增加，能很好地預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，但對(duì)其在成骨過(guò)程中的作用還不了解。國(guó)外研究表明，在卵巢切除的大鼠骨質(zhì)疏松模型中，NF-κB在成骨細(xì)胞中異常的活化。正常情況下，雌激素與雌激素受體結(jié)合能抑制NF-κB的表達(dá)，在卵巢切除的骨質(zhì)疏松模型中由于缺乏足夠的雌激素與雌激素受體結(jié)合導(dǎo)致 NF-κB 的異?；罨?－7］。因此本實(shí)驗(yàn)以MC3T32-E1細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)KP在整個(gè)成骨增殖、分化、礦化過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的影響，同時(shí)探討在此過(guò)程中KP對(duì)MC3T3-E1 NF-κB活性的影響。

在骨形成過(guò)程中，成骨細(xì)胞的增殖分化可分為成骨細(xì)胞增殖期、細(xì)胞外基質(zhì)成熟期及細(xì)胞外基質(zhì)礦化期3個(gè)不同的階段，每個(gè)階段都有特定的標(biāo)志物。

成骨細(xì)胞增殖期是以細(xì)胞的增殖為特征。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KP對(duì)MC3T32-E1無(wú)細(xì)胞毒作用，不抑制其增殖;同時(shí)中、高濃度的KP能明顯促進(jìn)MC3T3-E1增殖，特別是 50、100 mg·L－1KP作用24、48、72 h后(P ＜0.01)，見 Fig 1。這證實(shí) KP 是一種低毒且促增殖的生長(zhǎng)促進(jìn)因子。

在細(xì)胞外基質(zhì)成熟期，能明顯的檢測(cè)到ALP和Ⅰ型膠原蛋白活性的特異性升高。ALP是反映成骨細(xì)胞分化早期活性的特異指標(biāo)，ALP在成骨細(xì)胞分化早期處于一個(gè)上升的過(guò)程，在此過(guò)程中其表達(dá)的多少能反映出成骨細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明100 mg·L－1KP作用于MC3T3-E1 9、12、15 d能明顯促進(jìn)其 ALP活性(P ＜0.01)，見Fig 2;Ⅰ型膠原蛋白是成骨細(xì)胞分泌的一種基質(zhì)蛋白，作為骨膠原的重要組成部分為細(xì)胞外基質(zhì)礦化提供支架，其反映了成骨細(xì)胞分化中期的活性。而羥脯氨酸是衡量Ⅰ型膠原蛋白價(jià)值的重要指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中羥脯氨酸的含量能間接的反映細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白的含量。50、100 mg·L－1KP在作用MC3T3-E1 24 d后能明顯地提高細(xì)胞中羥脯氨酸的含量(P＜0.01)，見Fig 3。因此，在MC3T3-E1分化成熟的早期和中期KP都能提高其分化的活性，促進(jìn)骨的形成。

Fig 5 Anaysis of p65，p50 and β-actin protein expression in MC3T3-E1 by Western blot(n=3)

在細(xì)胞外基質(zhì)礦化期，是以骨結(jié)節(jié)的形成及數(shù)量為特征。骨結(jié)節(jié)是分化成熟成骨細(xì)胞形成多層疊加的結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)，同時(shí)骨結(jié)節(jié)是衡量成骨細(xì)胞分化晚期活性的指標(biāo)。50、100 mg·L－1KP能夠促進(jìn)30 d MC3T3-E1的骨結(jié)節(jié)形成(Fig 4)，從而反映KP對(duì)分化晚期的成骨細(xì)胞也有促進(jìn)作用。

而NF-κB信號(hào)通路在成骨細(xì)胞的增殖分化和凋亡過(guò)程中都有著重要的作用［8］。目前研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松時(shí)，T細(xì)胞和其他細(xì)胞高度表達(dá)炎癥細(xì)胞因子如:TNF-α、IL-6、IL-1等，能促進(jìn)成骨細(xì)胞中NF-κB 活化［9］，活化的 NF-κB 同時(shí)能促進(jìn) TNF-α、IL-6、IL-1 的轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)增加［10］，NF-κB 與炎癥細(xì)胞因子形成一個(gè)循環(huán)放大的過(guò)程。大量NF-κB的活化，能夠抑制多個(gè)成骨關(guān)鍵因子(如:Runx2、osterix、ALP、骨涎蛋白、Ⅰ型膠原蛋白)的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)的礦化［11］，從而使骨形成受到抑制，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。我們的Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，KP能夠明顯抑制MC3T3-E1不同生長(zhǎng)時(shí)期(3、12、24、30 d)的 NF-κB p50 和 p65 蛋白的表達(dá)(P ＜0.01)(Fig 5)。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KP在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、成骨基質(zhì)蛋白ALP和I型膠原蛋白特異氨基酸(羥脯氨酸)表達(dá)、礦化結(jié)節(jié)的形成的同時(shí)能抑制MC3T3-E1細(xì)胞不同生長(zhǎng)時(shí)期的NF-κB p50和p65蛋白表達(dá)。因此，我們推斷KP促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖分化可能是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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