孔 祥，楊解人，張明義，吳向起

(皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽蕪湖 241002)

代謝綜合癥(metabolic syndrome，MS)是以胰島素抵抗為病理生理基礎(chǔ)，伴有中心性肥胖、高血脂、高血壓、糖尿病或空腹血糖增高的癥候群［1］。MS中的每個(gè)致病因素均能對(duì)心臟造成嚴(yán)重危害。隨著MS發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，心血管并發(fā)癥亦急劇增加。芝麻具有“補(bǔ)肝腎、潤(rùn)五臟、增氣力、消炎止痛、生發(fā)”等功效，長(zhǎng)久以來(lái)一直被視為滋補(bǔ)圣品。芝麻素(sesamin，Ses)是從芝麻中提取出的活性成份，藥用價(jià)值日益受到重視。日本學(xué)者報(bào)道［2－3］Ses對(duì)于高血脂和高血壓患者有一定的降脂和降壓作用。我們之前研究報(bào)道［4－5］Ses通過(guò)抗氧化應(yīng)激改善飲食誘導(dǎo)的MS大鼠心肌和腎臟損傷，通過(guò)降低c-fos蛋白表達(dá)逆轉(zhuǎn)腎性高血壓伴高血脂大鼠心肌肥厚［6］，但Ses對(duì)兩腎一夾術(shù)伴高脂高糖飲食誘導(dǎo)的MS大鼠心肌重構(gòu)的影響尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

硝基酪氨酸(NT)是內(nèi)源性過(guò)氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO－)的特異性標(biāo)記物。核因子-κB(NF-κB)作為重要的轉(zhuǎn)錄因子在心肌炎癥反應(yīng)、細(xì)胞壞死、凋亡等病理生理過(guò)程發(fā)揮重要作用。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)的鋅依賴(lài)性蛋白酶家族，在心肌重構(gòu)中起重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用兩腎一夾術(shù)伴高糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠MS模型，觀察Ses對(duì)大鼠心肌組織中NT、NF-κB和MMP-9蛋白表達(dá)的影響，以探討其防治MS大鼠心肌重構(gòu)的作用及可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物和飼料♂SD大鼠52只，體質(zhì)量200～240 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào):SCXK(京)2007-0001。解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心嚙齒類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。飼料配方見(jiàn)作者之前報(bào)道［7］，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制作，許可證號(hào):SCXK(軍)2002-018。高糖高脂飼料含有18%蛋白質(zhì)，22%脂肪(含15%熟豬油和2%膽固醇)，46%碳水化合物(含25%蔗糖)。飼料的熱量組成和密度如下，高糖高脂飼料:蛋白16%，脂肪44%，碳水化合物40%和4.5 Kcal·g－1;普通飼料:蛋白 28%，脂肪13%，碳水化合物 59%和 3.1 Kcal·g－1。

1.2 主要試劑和藥物Ses(純度＞94%)，由蕪湖天一綠寶科技有限公司提供(批號(hào)04312)［7］;甘油三酯(triglyceride，TG)和總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療公司;胰島素(insulin，Ins)放免試劑盒購(gòu)自北京普爾偉業(yè)生物科技公司;總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;NT和NF-κB p65抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;MMP-9和β-actin抗體購(gòu)自武漢博士德公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;ECL試劑盒購(gòu)于Pierce公司。

Tab 1 Effects of Ses on BW，SBP and lipid metabolism in MS rats( ± s)

Tab 1 Effects of Ses on BW，SBP and lipid metabolism in MS rats( ± s)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs model

Group Dose/mg·kg－1 n BW/g SBP/kPa TG/mmol·L －1 TC/mmol·L －1±0.48 Model － 10 630.5 ±27.1* 23.6 ±0.91* 2.06 ±0.49* 3.47 ±1.27*Ses 120 8 563.3 ±40.5# 18.6 ±1.21# 1.41 ±0.36*# 2.36 ±0.52*#60 8 587.9 ±35.0* 20.2 ±1.21*# 1.65 ±0.22*# 2.82 ±0.45*30 8 611.3 ±43.8* 21.6 ±0.87* 1.83 ±0.32* 3.20 ±0.62 Sham － 10 523.2 ±31.3 15.4 ±0.79 0.90 ±0.33 1.17*

2 方法

2.1 模型制備、分組及處理Goldblatt法復(fù)制大鼠腎性高血壓模型，適應(yīng)1周后除假手術(shù)組外，其余大鼠給予高糖高脂飼料12周。NIBP無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)定分析系統(tǒng)檢測(cè)大鼠收縮壓(systolic blood pressure，SBP)［7，8］，術(shù)后 5 周達(dá) 21.3 kPa 以上的 44 只大鼠隨機(jī)分為 MS模型組(model，n=10)，Ses高、中、低劑量治療組(120、60、30 mg·kg－1，n=8)，另設(shè)假手術(shù)組(sham，n=10)。Ses用0.5%羧甲基纖維素制成混懸液，假手術(shù)和模型組給予等容積羧甲基纖維素。于每日上午9時(shí)灌胃給藥，1 h后自由進(jìn)食，連續(xù)給藥8周。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后(13周末)，大鼠禁食 12 h，稱(chēng)體重(body weight，BW)，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，分離血清。迅速開(kāi)胸，取心臟，稱(chēng)全心濕重(heart wet weight，HWW)和左心室濕重(left ventricle wet weight，LVWW)。取部分心肌用10%甲醛固定，用于HE和Masson染色，部分凍存于－80℃冰箱備用。

2.2 血液指標(biāo)檢測(cè)酶法測(cè)定血清TC、TG含量，血糖儀測(cè)定大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，放免法測(cè)血清Ins水平，比色法測(cè)血清T–AOC，具體步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)，并嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)正規(guī)操作。采用李氏法［9］計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitive index，ISI):ISI=Ln(1/FBG ×FIns)。

2.3 Western blot檢測(cè)心肌 NT、NF-κB 和 MMP-9蛋白表達(dá)參照 Schreiber等［10］和作者之前的報(bào)道［7］，分別提取心肌組織核蛋白和總蛋白，取上清用Lowry法進(jìn)行蛋白定量。以40 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫封閉2 h。洗膜后分別加入一抗(NT 1∶800;NF-κB p65 1 ∶1 000;MMP-9 和 β-actin 1 ∶500稀釋)4℃孵育過(guò)夜。洗膜后二抗(1∶2 500稀釋)室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，拍攝照片。根據(jù)積分吸光度(integrated absorbance，IA)值對(duì)比分析條帶強(qiáng)弱，以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行半定量分析。

2.4 心肌組織病理學(xué)檢查石蠟橫斷面連續(xù)切片5～6片，厚度約5 μm，切片常規(guī)脫蠟脫水，HE染色觀察心肌病理改變。Masson染色后，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0 Software圖像分析系統(tǒng)，將圖像放大400倍，隨機(jī)選取10個(gè)視野，通過(guò)測(cè)量選定區(qū)域染色組織的面積(藍(lán)色代表膠原纖維)，計(jì)算每個(gè)視野中膠原面積與心肌組織總面積的比值，取其均值即為每只大鼠膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)。含膠原豐富的冠脈細(xì)小血管區(qū)域不納入測(cè)量范圍內(nèi)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，采用SPSS 13.0軟件分析，多組間比較采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)BW、SBP和血脂的影響MS模型組BW、SBP、TG和TC較假手術(shù)組增高(P＜0.05)。與模型組相比，Ses 120、60 mg·kg－1組 SBP 和 TG 明顯降低;120 mg·kg－1組 BW 和 TC明顯降低(P＜0.05)，表明Ses具有降低血壓和血脂的作用，與作者之前報(bào)道一致(Tab 1)。

3.2 對(duì)FBG、Ins水平和 ISI的影響MS模型組FBG和血清Ins水平增高，ISI明顯降低(P＜0.05)。與模型組相比，Ses 120、60 mg·kg－1組 FBG、Ins水平降低，ISI明顯上升(P＜0.05)，說(shuō)明Ses具有降低血糖和改善胰島素敏感性的作用(Tab 2)。

Tab 2 Effects of Ses on FBG，INS level and ISI in MS rats(±s)

Tab 2 Effects of Ses on FBG，INS level and ISI in MS rats(±s)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs model

Group Dose/mg·kg－1n FBG/mmol·L －1 Ins/mIU·L－1ISI Sham － 10 4.22 ±0.26 15.2 ±6.6 －4.07 ±0.51 Model － 10 5.46 ±0.41* 62.6 ±18.4* －5.79 ±0.39*Ses 120 8 4.58 ±0.34# 32.8 ±9.9*# －4.97 ±0.40*#60 8 4.85 ±0.31*#41.8 ±11.6*#－5.28 ±0.34*#30 8 5.14 ±0.39* 52.4 ±14.3* －5.56 ±0.37*

3.3 對(duì)HWW、LVWW和T-AOC的影響MS模型組HWW和LVWW增高，血清T-AOC明顯降低(P ＜0.05)。與模型組相比，Ses 120、60 mg·kg－1組HWW 降低，T-AOC明顯上升;120 mg·kg－1組LVWW降低(P＜0.05)，表明Ses具有改善心肌肥厚和抗氧化應(yīng)激的作用(Tab 3)。

Tab 3 Effects of Ses on HWW，LVWW and T-AOC in MS rats(±s)

Tab 3 Effects of Ses on HWW，LVWW and T-AOC in MS rats(±s)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs model

Group Dose/mg·kg－1n HWW/g LVWW/g T-AOC/kU·L －1 Sham － 10 1.23 ±0.11 0.85 ±0.06 28.4 ±14.9 Model － 10 1.86 ±0.21* 1.54 ±0.20* 7.49 ±4.8*Ses 120 8 1.37 ±0.11# 1.03 ±0.12# 22.5 ±8.2#60 8 1.48 ±0.19*#1.25 ±0.19* 14.7 ±6.4*#30 8 1.69 ±0.13* 1.44 ±0.15* 10.2 ±3.7*

3.4 對(duì)心肌病理變化和CVF的影響HE染色可見(jiàn)，MS模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，肌纖維增粗肥大，組織中可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Ses 120 mg·kg－1組病理變化較模型組明顯改善(Fig 1A～C)。光鏡下Masson染色顯示膠原纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色。鏡下觀察和半定量分析表明MS模型組心肌間質(zhì)膠原纖維明顯增多，排列紊亂，分布不均，CVF明顯增高(P＜0.05)。Ses 120 mg·kg－1組膠原積聚明顯減輕，排列趨于規(guī)則，CVF降低(P＜0.05，F(xiàn)ig 1D ～G)。

Fig 1 Effects of Ses on pathological changes of myocardium and CVF in MS rats

Fig 2 Effects of Ses on myocardial protein expression of NT，NF-κB and MMP-9 in MS rats

3.5 對(duì)心肌NT、NF-κB和MMP-9蛋白表達(dá)的影響由 Fig 2可見(jiàn)，MS模型組心肌 NT、NF-κB和MMP-9蛋白表達(dá)較假手術(shù)組分別增加2.03、1.81和2.40 倍(P ＜0.05)。Ses120、60 mg·kg－1組 NT表達(dá)較模型組降低44%和21%，NF-κB表達(dá)降低37%和26%，MMP-9表達(dá)降低50%和41%(P＜0.05)。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩腎一夾術(shù)和高糖高脂飲食13周誘導(dǎo)的MS大鼠存在高血壓、高血脂和高血糖的“三高”癥狀，同時(shí)伴有胰島素抵抗，說(shuō)明模型制備成功。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)大鼠全心濕重、左室濕重明顯增加，心肌纖維增粗肥大，排列紊亂，心肌間質(zhì)膠原纖維增多，提示MS大鼠模型在具備代謝紊亂的基礎(chǔ)上，伴有嚴(yán)重心肌損傷和重構(gòu)癥狀。我們前期研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期高糖高脂飲食可誘導(dǎo)以代謝紊亂為主要特點(diǎn)的MS大鼠模型，予以Ses治療可改善其輕度的心肌損傷［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，兩腎一夾術(shù)伴高脂高糖飲食制備的MS模型予以Ses治療8周后，大鼠體重、全心濕重和左室濕重明顯降低，心肌膠原纖維明顯減少，證明Ses具有改善MS大鼠心肌肥厚和抗纖維化的作用。

T-AOC是反映機(jī)體整體抗氧化水平的重要指標(biāo)之一。ONOO－是由活性氧中的超氧陰離子與NO迅速反應(yīng)生成的產(chǎn)物，是活性和毒性很強(qiáng)的氧化劑，可代表氧化應(yīng)激水平的升高。ONOO－性質(zhì)活潑，不易檢測(cè)，但其在體內(nèi)可與酪氨酸殘基結(jié)合生成穩(wěn)定的終末代謝物NT。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MS大鼠血清TAOC明顯降低，心肌ONOO－特異性標(biāo)記物NT蛋白表達(dá)明顯增高，提示氧化應(yīng)激在MS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Ses治療8周后T-AOC升高，NT表達(dá)減少，說(shuō)明改善氧化應(yīng)激狀態(tài)是Ses防治MS心肌損傷的機(jī)制之一，與我們之前結(jié)論一致［4］。

NF-κB是一種廣泛存在的核轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下主要由p50/p65異源二聚體與抑制物IκB結(jié)合形成無(wú)活性的三聚體。機(jī)體受到外界刺激后，IκB解離、降解，p50/p65移位進(jìn)入細(xì)胞核。p65與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。因此，p65亞基被認(rèn)為是NF-κB表達(dá)最廣泛，活性最強(qiáng)的亞單位。文獻(xiàn)報(bào)道NF-κB調(diào)控和轉(zhuǎn)錄的多種細(xì)胞因子在心臟炎癥反應(yīng)和器官損傷中發(fā)揮重要作用［11］。MMPs包括膠原酶、明膠酶和基質(zhì)溶解素等，是一類(lèi)分解細(xì)胞外基質(zhì)的鋅依賴(lài)性蛋白酶家族，在心肌組織重構(gòu)中起重要作用。明膠酶(MMP-9)的特性近年來(lái)備受關(guān)注，認(rèn)為其通過(guò)刺激纖維性膠原合成參與纖維化的發(fā)生［12］。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)MS大鼠左室肥大和膠原沉積，同時(shí)心肌NF-κB p65和 MMP-9蛋白表達(dá)增加。Ses治療后可降低蛋白表達(dá)，提示Ses防治心肌重構(gòu)機(jī)制與下調(diào)NF-κB和MMP-9表達(dá)有關(guān)。

研究證明活性氧能直接或間接激活各種下游信號(hào)通路，對(duì)心肌產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，在心臟疾病發(fā)生和發(fā)展中起信號(hào)分子作用。文獻(xiàn)報(bào)道活性氧能使IκB解離，使得NF-κB p65進(jìn)入核中與DNA結(jié)合，啟動(dòng)或加強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄［13］，增加心衰模型心肌MMPs表達(dá)和活性［14］。本研究中Ses降低MS大鼠心肌NF-κB和MMP-9蛋白表達(dá)作用是其自身的藥理學(xué)特性，還是依賴(lài)于Ses抗氧化作用的繼發(fā)結(jié)果尚需進(jìn)一步探討。近年來(lái)，Wu等［15］發(fā)現(xiàn)Ses能降低腫瘤壞死因子(TNF)處理的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活性和蛋白表達(dá)。Harikumar等［16］報(bào)道Ses能降低TNF處理的人慢性白血病KBM-5細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)，多種炎癥、致癌因素處理的KBM-5細(xì)胞NF-κB活性。因此，結(jié)合上述報(bào)道，我們認(rèn)為Ses改善MS心肌重構(gòu)的機(jī)制除抗氧化應(yīng)激外，還與下調(diào)NF-κB和MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)，但確切機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

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