劉麗萍，唐蘇蘇，王建青，姜荔瑩，張 茜，王肖雲(yún)，王 偉，洪 浩

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽合肥 230031;2.中國(guó)藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室，江蘇南京210009)

糖尿病認(rèn)知功能損害是臨床上常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。一般認(rèn)為與腦內(nèi)蛋白非酶糖基化、腦血管損傷、腦神經(jīng)遞質(zhì)改變及神經(jīng)元凋亡等因素有關(guān)［1－2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病動(dòng)物腦內(nèi)β分泌酶活性增高以及血腦屏障β淀粉樣蛋白(β amyloid protein，Aβ)轉(zhuǎn)運(yùn)失衡導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ水平異常升高，特別是海馬區(qū)Aβ42聚集，海馬區(qū)突觸信息傳遞受損，突觸可塑性下降，學(xué)習(xí)記憶能力減退［3－5］。因此研究糖尿病認(rèn)知功能障礙的病理生理機(jī)制及防治藥物具有重要理論和實(shí)際意義。纈沙坦(valsartan)為一臨床上常用的血管緊張素Ⅱ受體1型(即AT1受體)拮抗劑，主要用于治療高血壓。最近不斷研究報(bào)道，AT1受體拮抗劑如纈沙坦、替米沙坦等可以明顯改善阿爾采末病(Alzheimer's disease，AD)模型動(dòng)物認(rèn)知功能障礙［6－7］。由于糖尿病與AD具有共同的發(fā)病機(jī)制如胰島素抵抗、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)活化及炎癥反應(yīng)等［9］，因此，AT1受體拮抗劑纈沙坦可能對(duì)糖尿病小鼠認(rèn)知損害具有改善作用。本論文研究采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型，用Morris水迷宮試驗(yàn)評(píng)價(jià)纈沙坦對(duì)糖尿病小鼠認(rèn)知功能的影響，并探究其作用機(jī)制，從而為尋找防治糖尿病認(rèn)知損害的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物♂ ICR小鼠70只，清潔級(jí)，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(蘇)2007－0001。

1.2 藥物及試劑纈沙坦(海南澳美華制藥有限公司，批號(hào):091001);鏈脲佐菌素(Sigma，批號(hào):100712062);葡萄糖試劑盒及考馬斯亮藍(lán)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;小鼠Aβ40 ELISA試劑盒、小鼠Aβ42 ELISA試劑盒、小鼠β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(BACE1)ELISA試劑盒及小鼠胰島素ELISA試劑盒均購(gòu)自R＆D公司。

1.3 儀器Morris水迷宮(上海吉量軟件科技有限公司);16/18型紫外/可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司);酶標(biāo)儀(Perkin Elmer儀器有限公司);低溫離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室開發(fā)有限公司);Sartorius分析天平(北京多利斯天平有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 建立糖尿病小鼠模型及給藥 取♂ ICR小鼠70只，體質(zhì)量18～22 g，按體重隨機(jī)挑選10只為正常對(duì)照組;其它60只小鼠在禁食12 h后尾靜脈注射鏈脲佐菌素(150 mg·kg－1)，72 h后眼眶取血，采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹血糖。挑選血糖值≥11.1 mmol·L－1糖尿病小鼠隨機(jī)分為3組，即模型組、纈沙坦高劑量組(ValsartanⅠ，40 mg·kg－1·d－1)、纈沙坦低劑量組(ValsartanⅡ，10 mg·kg－1·d－1)，每組12只。正常組和模型組分別給予等體積的溶劑，每天一次，連續(xù)4～5周。

1.4.2 Morris水迷宮試驗(yàn) 為期5天，前4天為定位航行試驗(yàn)，d 5為空間搜索試驗(yàn)。水迷宮試驗(yàn)期間繼續(xù)每天灌胃給藥，于給藥30 min后進(jìn)行試驗(yàn)。①定位航行試驗(yàn):將水迷宮平臺(tái)置于第4象限，放入25℃左右水至沒過平臺(tái)5 mm。每天從1、2、3、4四個(gè)象限(4個(gè)入水點(diǎn))分別將小鼠面向池壁放入水中，使其自由游泳90 s，90 s內(nèi)小鼠找到平臺(tái)并上臺(tái)停留10 s后將其從平臺(tái)上取下休息，計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)并記錄小鼠從入水開始至爬上平臺(tái)所需的時(shí)間(潛伏期)及穿越平臺(tái)的次數(shù)等數(shù)據(jù)。若90 s內(nèi)動(dòng)物未找到平臺(tái)，則將小鼠引到平臺(tái)，并停留30 s，潛伏期記為90 s。②空間搜索試驗(yàn):試驗(yàn)d 5撤除平臺(tái)，任選一象限將各組小鼠依次從該象限面向池壁放入水中，使其自由游泳90 s，記錄小鼠在第4象限停留的時(shí)間占總時(shí)間的百分比(行為學(xué)測(cè)試過程中應(yīng)保持光線柔和，房間安靜，各參照物位置不變)。

1.4.3 血糖及胰島素測(cè)定 Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后小鼠禁食 12 h，眼眶取血，3 000 r·min－1離心15 min分離血清，分別按葡萄糖試劑盒和胰島素ELISA試劑盒說明書規(guī)定的方法測(cè)定空腹血糖和血清胰島素水平。

1.4.4 小鼠腦組織海馬區(qū)和皮層區(qū) Aβ40、Aβ42及BACE1含量測(cè)定 將小鼠斷頭取腦，用預(yù)冷生理鹽水沖洗表面血液，分離海馬和皮層，分別以重量/體積比1∶5加入4℃生理鹽水，制成約20%的勻漿，3 500 r·min－14℃ 離心 15 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明規(guī)定的方法測(cè)定Aβ40、Aβ42和BACE1含量，并用考馬斯亮藍(lán)定量蛋白。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均用±s表示。采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 纈沙坦對(duì)糖尿病小鼠Morris水迷宮行為學(xué)試驗(yàn)的影響在定位導(dǎo)航試驗(yàn)中，纈沙坦高劑量和低劑量組小鼠第4天的潛伏期均小于模型組，低劑量組與模型組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見Fig 1A;在空間探索試驗(yàn)中，纈沙坦高劑量和低劑量組小鼠在第4象限停留時(shí)間百分率均大于模型組(P＜0.05)，見Fig 1B，C。說明纈沙坦可以改善糖尿病小鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙。

2.2 纈沙坦對(duì)糖尿病小鼠血糖和胰島素水平的影響連續(xù)給予糖尿病小鼠纈沙坦40 mg·kg－1·d－1及 10 mg·kg－1·d－1，5 周后小鼠空腹血糖和胰島素水平與模型組相比無(wú)差異(P＞0.05)，見Fig 2A，B。

2.3 纈沙坦對(duì)糖尿病小鼠腦組織海馬區(qū)和皮層區(qū)Aβ40和Aβ42含量的影響ELISA分析結(jié)果顯示，纈沙坦高劑量和低劑量組小鼠腦組織海馬區(qū)Aβ40和Aβ42含量低于模型組(P＜0.05或P＜0.01)，見Fig 3A、4A;并且纈沙坦高劑量和低劑量組小鼠腦組織皮層區(qū)Aβ40含量也明顯低于模型組(P＜0.05，見Fig 3B);而皮層區(qū)Aβ42的含量未見明顯差異(P＞0.05，見Fig 4B)。說明纈沙坦能降低糖尿病小鼠腦海馬區(qū) Aβ40、Aβ42水平以及皮層區(qū)Aβ40水平，而對(duì)皮層區(qū)Aβ42水平無(wú)明顯影響。

2.4 纈沙坦對(duì)糖尿病小鼠腦組織海馬區(qū)和皮層區(qū)BACE1的影響纈沙坦高劑量和低劑量組小鼠腦組織海馬區(qū)BACE1的含量低于模型組(P＜0.05或P＜0.01)，見 Fig 5A。而皮層區(qū) BACE1的含量未見改變(P＞0.05)，見Fig 5B。說明纈沙坦降低糖尿病小鼠海馬區(qū)Aβ水平與抑制BACE1表達(dá)有關(guān)。

3 討論

Fig 1 Effects of valsartin on cognitive impairment in diabetic mice induced by streptozocin(±s，n=8～10)

Fig 2 Effects of blood glucose(a)and serum insulin(b)in diabetic mice Values are expressed as the(±s，n=5～10)

Fig 3 Effects of valsartin on Aβ40 content of hippocampus(A)and cortex(B)in streptozocin-induced diabetic mice(±s，n=5～6)

Fig 4 Effects of valsartin on Aβ42 content of the hippocampus(A)and cortex(B)in streptozocin-induced diabetic mice(±s，n=5～6)

Fig 5 Effects of valsartin on BACE1 content of the hippocampus(A)and cortex(B)in streptozocin-induced diabetic mice(±s，n=5～6)

糖尿病腦功能紊亂已在神經(jīng)化學(xué)、電生理、病理及神經(jīng)行為學(xué)等方面得到證實(shí)。糖尿病患者在學(xué)習(xí)、記憶和解決問題的能力、精神運(yùn)動(dòng)速度方面有明顯減退［1］。本次水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病小鼠在定位導(dǎo)航試驗(yàn)中的潛伏期較正常小鼠明顯增加，在空間探索試驗(yàn)中平臺(tái)所在象限停留時(shí)間百分率明顯減少，證實(shí)了糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶功能存在障礙。學(xué)習(xí)記憶與海馬神經(jīng)元有密切關(guān)系，海馬損傷后會(huì)喪失掌握新事物、新技巧的能力。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠海馬內(nèi)神經(jīng)元Aβ40和Aβ42含量明顯增加。Aβ42比Aβ40更具纖維原性和毒性，能募集更多的Aβ40和Aβ42，裝配形成以Aβ為主的寡聚體，這種寡聚體的神經(jīng)毒性進(jìn)一步增強(qiáng)［9］。

纈沙坦是一種易穿過血腦屏障的AT1受體拮抗劑，能降低AD模型小鼠腦內(nèi)Aβ水平并且改善其學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，纈沙坦(10、40 mg·kg－1·d－1)逐漸縮短糖尿病小鼠定位導(dǎo)航試驗(yàn)尋找平臺(tái)的潛伏期，增加糖尿病小鼠空間探索試驗(yàn)中平臺(tái)所在象限停留時(shí)間百分率，說明纈沙坦可以改善糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶損害。纈沙坦連續(xù)給藥5周糖尿病小鼠血糖和血清胰島素水平均未發(fā)生明顯的改變，提示纈沙坦改善糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶損害與胰島素信號(hào)和能量代謝無(wú)關(guān)。有趣的是纈沙坦能降低糖尿病小鼠海馬區(qū)β分泌酶(BACE1)水平，減少Aβ40和Aβ42生成，繼而可以減輕Aβ對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元損傷。纈沙坦還能降低糖尿病小鼠腦皮層區(qū)Aβ40合成，但對(duì)小鼠腦皮層區(qū) Aβ42和BACE1無(wú)明顯影響，提示纈沙坦可能具有調(diào)節(jié)糖尿病血腦屏障上Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)失衡的功能。

AT1受體是腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)主要組分，外周組織器官和中樞均有分布。近些年來腦內(nèi)RAS倍受關(guān)注，特別是AT1受體阻斷藥與認(rèn)知功能關(guān)系的研究屢見文獻(xiàn)報(bào)道［9］。糖尿病狀態(tài)下RAS活性異常升高，AT1受體表達(dá)上調(diào)，參與糖尿病多種并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程［10］。本研究選擇AT1受體拮抗劑纈沙坦兩個(gè)劑量即40 mg·kg－1·d－1及10 mg·kg－1·d－1不影響小鼠正常生理狀態(tài)如血壓、心功能等［6］，通過抑制糖尿病小鼠海馬區(qū)Aβ生成改善學(xué)習(xí)記憶損害，提示AT1受體上調(diào)可能參與糖尿病腦內(nèi)Aβ過度生成及記憶損害。本論文結(jié)果還顯示，纈沙坦低劑量比高劑量更有效，可能是因?yàn)榈蛣┝坷i沙坦改善認(rèn)知損害作用選擇性較高，而高劑量產(chǎn)生的藥理作用較廣泛，其它作用干擾了其改善認(rèn)知損害作用所致。

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