宋清曉，吳 勇，陳元仲

(福建省血液病研究所，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建福州 350001)

急性白血病是造血系統(tǒng)的惡性疾病，其特征是造血細(xì)胞增殖失控、分化障礙和凋亡受阻。白血病細(xì)胞可自發(fā)產(chǎn)生一些細(xì)胞因子，通過自泌環(huán)節(jié)作用于細(xì)胞本身的增殖、分化、凋亡。已知造血因子主要可分為兩大類。一類是正性造血細(xì)胞因子，如SCF、IL-1、IL-3、IL-6、IL-8、IL-11、G-CSF、GM-CSF、EPO、TPO等;另一類是負(fù)性造血細(xì)胞因子，主要有TGF-β1、TNF-α和IFNγ等。CD44分子是一種分布廣泛的細(xì)胞表面黏附分子，包括CD44S和CD44V，是細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ECM相互識別和作用的分子基礎(chǔ)，參與細(xì)胞間的黏附、淋巴細(xì)胞的活化、淋巴細(xì)胞歸巢或再循環(huán)、細(xì)胞的運(yùn)動及細(xì)胞內(nèi)外的信號傳導(dǎo)。由于CD44分子本身的生物學(xué)功能特性，決定了其可能成為一個治療急性髓系白血病的優(yōu)秀藥物靶點(diǎn)。而骨橋蛋白(osteopontin，OPN)作為CD44的配體，特異性地識別CD44V6，它參與了某些腫瘤細(xì)胞的侵襲、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移過程，但CD44抗體誘導(dǎo)急性髓系白血病原始細(xì)胞分化的過程中，OPN如何變化及起什么作用均未見報(bào)道。HI44a(IgG2a)是一種鼠源性的抗CD44單克隆抗體，其結(jié)合位點(diǎn)位于CD44分子胞外區(qū)臨近透明質(zhì)酸結(jié)合位點(diǎn)處。本實(shí)驗(yàn)研究HI44a對急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60的體外增殖與分化作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件HL-60細(xì)胞株系本所所藏，全反式維甲酸(ATRA，Sigma公司，美國)，CD44單克隆抗體HI44a(IgG2a，協(xié)和干細(xì)胞基因工程公司)。培養(yǎng)條件:含體積分?jǐn)?shù)為0.10的滅活胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)、置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日半量換液，存活細(xì)胞百分率(臺盼藍(lán)拒染法)＞95%。

1.2 HI44a對HL-60細(xì)胞增殖的影響取處于對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞重懸于體積分?jǐn)?shù)為10%的滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，分成HL-60、HL60+HI44a、HL-60+ATRA共3組，分別種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞濃度為1×108·L－1，HI44a終濃度為 40 mg·L－1，ATRA 終濃度為 1 μmol·L－1。置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)24、48、72、96 h后分別取細(xì)胞懸液用臺盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。取3孔平均值，以時間為橫坐標(biāo)，活細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3 HI44a對HL-60細(xì)胞分化的影響取對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞2×108·L－1加入終濃度為40 mg·L－1的HI44a，同時設(shè)置陰性及陽性對照組，分別加入終濃度為10 mg·L－1的 IgG2a和終濃度為1 μmol·L－1的 ATRA，置 37℃培養(yǎng)(條件同上)，于96 h收集細(xì)胞。

1.3.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查HI44a處理HL-60細(xì)胞前后細(xì)胞形態(tài)的變化 收集HL-60細(xì)胞及HI44a、ATRA處理96 h的HL-60細(xì)胞離心，涂片，晾干后行瑞氏染色，普通光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.3.2 流式細(xì)胞學(xué)檢測HI44a處理HL-60細(xì)胞前后細(xì)胞表面分化抗原CD11b、CD15的表達(dá)變化 取5 ×108·L－1培養(yǎng)后細(xì)胞，PBS 洗兩次，加入20 μl熒光標(biāo)記的鼠抗人CD11b或CD15抗體(BD公司)，同時以FITC標(biāo)記的IgG2a作為同型對照，4℃孵育30 min，PBS洗滌后，流式細(xì)胞儀檢測并分析。

1.4 RT-PCR檢測HI44a處理HL-60細(xì)胞前后TGFβ1、TGFβR1的表達(dá)收集各組細(xì)胞，提取總RNA，準(zhǔn)確定量后合成cDNA，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μl，含 cDNA 1 μl，2 × Tag PCR MasterMix 10 μl(TIANGEN)，上、下游引物各0.5 pmol，置 DNA擴(kuò)增儀(2400型，PE公司)擴(kuò)增。同時以β-肌動蛋白(β-actin)的mRNA擴(kuò)增作為內(nèi)參照。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析儀分析。

1.5 熒光定量 RT-PCR 法檢測 OPN、IL3-Rα、GM-CSFRα、HβC mRNA的表達(dá)收集各組細(xì)胞，提取總RNA，準(zhǔn)確定量后合成cDNA，再采用SYBR Green(BD公司)進(jìn)行定量PCR，總反應(yīng)體系20 μl，含 2 × SYBR Green PCR Mix 9 μl，上、下游引物各0.5 pmol，cDNA 2 μl。熒光定量 PCR 結(jié)果采用相對定量法=2－△△CT分析。反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)、各基因引物及PCR參數(shù)，見Tab 1。

Tab 1 The sequences of primers，the sizes of amplified fragments，the annealing temperatures and cycles for PCR

1.6 DNA序列分析檢測HI44a處理HL-60細(xì)胞前后OPN異構(gòu)體的變化

1.6.1 PCR 反應(yīng) 總反應(yīng)體系 50 μl，采用高保真酶(platinum Taq DNA polmerase high fidelity)，反應(yīng)體系如下:10 × High fielidty Buffer 5 μl，2.5 mmol·L－1each dNTP Mix 4 μl，50 mmol·L－1MgSO42 μl，上、下游引物各 1 pmol，Platium Taq 0.2 μl，cDNA 3 μl。OPN編碼區(qū)序列上游引物為:5'-TGCAGCCTTCTCAGCCAAAC-3'，下游引物 為:5'-TTACAGGGAGTTTCCATGAAGCC-3'。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min 后，94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，68℃ 延伸 2 min，共35個循環(huán)，再68℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1 200 bp。

1.6.2 OPN PCR產(chǎn)物純化及測序 回收PCR產(chǎn)物按割膠回收試劑盒(General Electric Company)說明書進(jìn)行，將純化產(chǎn)物連接至T載體上(Promega公司產(chǎn)品)，將所連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌JM-109細(xì)胞，用牙簽挑取數(shù)個白色菌落，采用PCR方法鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳可見目的基因擴(kuò)增帶，將HL-60組、HI44a及ATRA組各挑取8個菌落加5 ml含氨芐的LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖過夜，按(General Electric Company)試劑盒提取質(zhì)粒DNA，在紫外分光光度儀上準(zhǔn)確定量后進(jìn)行測序反應(yīng)，總反應(yīng)體系 10 μl，含 Big Dye terminator Mix 1.0 μl，5 × buffer 1.5 μl，1 pmol引物 1.6 μl，質(zhì)粒 DNA 300 ng。反應(yīng)條件:96℃預(yù)變性2 min后，96℃變性20 s，50℃退火 10 s，60℃延伸 4 min，共 25 個循環(huán)。將測序反應(yīng)產(chǎn)物純化后跑測序膠，計(jì)算機(jī)分析結(jié)果。

1.7 ELISA法檢測各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基上清中的OPN水平OPN ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司，按照試劑盒說明書操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間均值比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HI44a對HL-60細(xì)胞增殖的影響HI44a組HL-60細(xì)胞增殖受抑制，但不如ATRA明顯。

2.2 HI44a對HL-60細(xì)胞分化的影響

2.2.1 HI44a處理HL-60細(xì)胞前后細(xì)胞形態(tài)變化HL-60細(xì)胞與40 mg·L－1的HI44a共培養(yǎng)后，細(xì)胞表現(xiàn)為體積變大、核固縮、核質(zhì)比例降低、核仁減少、出現(xiàn)核分葉等往成熟細(xì)胞分化的表觀特征。見Fig 2。

2.2.2 HI44a處理HL-60細(xì)胞前后細(xì)胞表面分化抗原的表達(dá)變化 (1)HI44a作用后，CD15表達(dá)上調(diào)，但不如ATRA組明顯，CD11b表達(dá)無明顯改變。結(jié)果見Tab 2。

Fig 1 Effects of HI44a on the proliferation of HL-60 cells

Fig 2 Effects of HI44a on the differentiation of HL-60 cells(HP×200)

Tab 2 The levels of CD15 and CD11b detected by flow cytometry in the HL-60 group，HI44a group and ATRA group

2.2.3 RT-PCR 檢測各組細(xì)胞 TGF-β1、TGF-βR1 mRNA表達(dá)水平 HL-60細(xì)胞在與HI44a共同培養(yǎng)96 h 后，TGF-β1mRNA 表達(dá)增高，TGF-βR1 表達(dá)水平無明顯變化。見Fig 3、4。

2.2.4 熒光定量RT-PCR法檢測HI44a誘導(dǎo)HL-60分化過程中表達(dá) OPN、GM-CSFRα、HβC 、IL3-RαmRNA的變化，結(jié)果采用相對定量法 =2－△△CT分析，結(jié)果顯示經(jīng)HI44a處理的HL-60細(xì)胞OPN表達(dá)下調(diào)，GM-CSFRα表達(dá)上調(diào)。見Fig 5、6。

與HL-60組比較，HI44a組OPN mRNA表達(dá)下調(diào)0.60倍，ATRA組OPN mRNA表達(dá)下調(diào)0.69倍，IgG2a組OPN mRNA表達(dá)上調(diào)1.07倍，結(jié)果見Fig 5。

Fig 3 Expression of TGF-β1mRNA in HL-60 group，HI44a group and ATRA group detecded by RT-PCR

Fig 4 Expression of TGFβR1 mRNA in HL-60 group，HI44a group，IgG2a control group and ATRA control group detecded by RT-PCR

Fig 5 Expression of OPN mRNA in HL-60 group，HI44a group，IgG2a control group and ATRA control group detecded by fluorescence quantitative PCR

與 HL-60組比較，HI44a組GM-CSFRα mRNA表達(dá)上調(diào)4.63倍，ATRA組GM-CSFRα mRNA表達(dá)上調(diào)3.48倍，IgG2a組GM-CSFRα mRNA表達(dá)上調(diào)2.09倍，結(jié)果見Fig 6。

Fig 6 Expression of GM-CSFRα mRNA in HL-60 group，HI44a group，IgG2a control group and ATRA control group detecded by fluorescence quantitative PCR

2.3 OPN基因序列分析結(jié)果DNA序列分析OPN存在3種分子量大小不同的異構(gòu)體，與基因庫比對，分別為 isoform A、isoform B、isoform C。isoform A為314個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，isoform B為300個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，isoform C為287個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。各組測序結(jié)果見Tab 3。

Tab 3 The composition of three osteopontin isoforms studied by full-length cDNA of osteopontin sequence analysis

2.4 實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞培養(yǎng)基中的OPN水平比較HI44a組OPN水平明顯低于HL-60組及IgG2a組，結(jié)果見Tab 4。

Tab 4 The level of osteopontin

3 討論

急性白血病是造血干細(xì)胞的惡性克隆疾病，目前西醫(yī)多采用化療、骨髓移植等方法來治療，雷公藤［1］、肉蓯蓉［2］、大蒜素［3］等傳統(tǒng)中藥提取物抗白血病的研究也取得一定成果，現(xiàn)在更多的學(xué)者把目光轉(zhuǎn)向了分子靶向治療。CD44作為白血病干細(xì)胞的標(biāo)志之一，對急性髓系白血病干細(xì)胞的增殖和遷移等起重要的調(diào)節(jié)作用。在急性髓系白血病細(xì)胞上，主要表達(dá) CD44s及 CD44v3-v10，其中以表達(dá)CD446v為主，急性髓系白血病患者CD44-6v的高表達(dá)提示其預(yù)后欠佳［4］，故CD44-6v可能有助于促進(jìn)急性髓系白血病幼稚細(xì)胞的形成［5］。另外，對急性髓系白血病病人的研究還發(fā)現(xiàn)，骨髓中骨橋蛋白的含量遠(yuǎn)高于正常人，而且其含量越高，預(yù)后越差［6］。

據(jù)報(bào)道，CD44抗體A3D8-H90或透明質(zhì)酸能夠逆轉(zhuǎn)M1-M5各亞型的AML細(xì)胞及細(xì)胞系的分化阻滯，Song等［7］還發(fā)現(xiàn)另一種抗CD44抗體HI44a能夠有效的誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化及凋亡。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)CD44抗體HI44a處理的HL-60細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為細(xì)胞核變小，核質(zhì)比例變大;粒系分化的指標(biāo)CD15表達(dá)增強(qiáng)，說明HI44a能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向粒系分化成熟。我們的結(jié)論與Song等的結(jié)論相符。

CD44V可以特異性的結(jié)合骨橋蛋白(OPN)［8－10］，介導(dǎo) T 細(xì)胞、骨髓細(xì)胞的趨化和黏附作用［8，10－11］，抗 CD44 抗體可以削減 OPN 與 IL-3 對小鼠骨髓細(xì)胞的增殖作用［11］。OPN-CD44的相互作用在GM-CSF所介導(dǎo)的抗凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用，當(dāng)信號分子GM-CSF通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促使編碼OPN的基因表達(dá)，產(chǎn)生OPN，與細(xì)胞表面的受體CD44分子作用后通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)傳遞GM-CSF的抗凋亡信號［12］，研究者還發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞增殖過程中，OPN的表達(dá)逐漸增高，這與其抗凋亡的作用相符，因此，研究者致力于從OPN基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子中尋找特異靶點(diǎn)而阻斷其抗凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)［5］。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HI44a處理的HL-60細(xì)胞，增殖受抑，且漸向較成熟階段細(xì)胞分化，OPN表達(dá)下調(diào)，TGF-β1、GM-CSFRα 表達(dá)上調(diào)，推測 HI44a結(jié)合CD44分子后，阻斷了OPN-CD44所參與的信號通路中抗凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得抗凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號分子OPN表達(dá)降低，而促凋亡的造血因子TGF-β1及促分化的信號分子GM-CSFRα表達(dá)增高，可能通過此相關(guān)途徑引發(fā)細(xì)胞的分化及凋亡，但確切機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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