張艷俠，劉丹花，角燦武，付潤(rùn)芳，程亮星

(1.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河南 鄭州 450001;2.國(guó)際眼科雜志社，陜西西安 710054;3.濮陽市人民醫(yī)院藥劑科，河南濮陽 457000)

隨著冠脈搭橋術(shù)、溶栓療法以及心臟外科體外循環(huán)術(shù)等方法在臨床工作中的廣泛開展，MIRI成為亟待解決的問題。PGE1具有擴(kuò)張外周血管和冠狀血管，降低外周阻力和血壓，保護(hù)缺血性心肌，縮小心肌梗死面積等作用［1］。以往研究［2－4］已經(jīng)從多方面證實(shí)PGE1對(duì)心肌具有保護(hù)作用，而對(duì)PGE1預(yù)處理在離體大鼠MIRI中PKC所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其與HSP70之間的聯(lián)系，尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定PKC和HSP70的表達(dá)，以探討PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在PGE1預(yù)處理對(duì)大鼠MIRI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與試劑 SD大鼠，♂♀各半，體質(zhì)量(300±50)g(河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。前列腺素E1粉針劑(南陽普康藥業(yè)有限公司，批號(hào):200802201)。小鼠抗PKC抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。兔抗HSP70抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。SP免疫組化染色試劑盒(美國(guó)ZYMED公司)。

1.1.2 主要儀器 Langendorff灌流裝置(自制);電泳轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-rad公司;倒置顯微鏡，日本Nikon公司;多媒體彩色圖像分析軟件，上海山富科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)分組 40只大鼠隨機(jī)分成5組:正常對(duì)照組(C組)，缺血/再灌注組(I/R組)，PGE114，42，126 μg·L－1預(yù)處理組，每組 8 只。

1.2 方法

1.2.1 大鼠離體心臟缺血/再灌注模型的制備200 mg·L－1烏拉坦(5 ml·kg－1)ip 麻醉大鼠，肝素500 IU抗凝。迅速開胸取心，置于4℃無鈣臺(tái)式液，經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管，一號(hào)絲線結(jié)扎，掛于Langendorff裝置上，灌流20 min，灌流液為正常臺(tái)式液，其組成為(mmol·L－1):NaCl 140，KCl 5.4，HEPES 10，MgCl21，CaCl22，Glucose 10，pH=7.4 with NaOH，待心率＞200次·min－1，灌流正常臺(tái)式液或含PGE1的正常臺(tái)式液30 min，停灌30 min，再用正常臺(tái)式液灌流30 min。灌流過程中保持灌流液在37℃。

1.2.2 心肌纖維形態(tài)學(xué)觀察 取心肌組織，100 g·L－1多聚甲醛固定24h后，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色觀察。

1.2.3 心肌組織PKC表達(dá)的測(cè)定 提取組織蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量。上樣后 SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜(100 V，1 h)，5%脫脂奶粉封閉，一抗(1∶100)孵育，4℃過夜，二抗(1∶1 000)孵育，室溫2 h。化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。所得條帶通過Quantity-one 4.6.2軟件測(cè)灰度值，以各組PKC/β-actin進(jìn)行半定量分析。

Fig 1 Effect of PGE1on the morphological changes in rat heart(HE，×400)

1.2.4 心肌組織HSP70表達(dá)的測(cè)定 取心肌組織于100 g·L－1甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、烤片。切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)。3 L·L－1H2O2去離子水室溫孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。血清封閉液封閉組織非特異性抗原20 min。HSP70一抗孵育，4℃過夜。生物素化二抗室溫下孵育15 min。辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，室溫下孵育15 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。顯微鏡下照相，通過多媒體彩色圖像分析軟件，每張圖片取5個(gè)視野測(cè)得陽性區(qū)面積百分比。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 心肌纖維形態(tài)學(xué)變化光鏡下，C組心肌纖維完整，染色均勻，排列整齊緊密，間質(zhì)未見血管擴(kuò)張和炎細(xì)胞浸潤(rùn)(Fig 1A);I/R組大范圍心肌纖維斷裂、腫脹，結(jié)構(gòu)紊亂，局部呈波紋狀改變，間質(zhì)血管可見明顯擴(kuò)張，有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(Fig 1B);PGE1各預(yù)處理組均有不同程度的改善，PGE114 μg·L－1預(yù)處理組組心肌纖維腫脹、排列紊亂，間質(zhì)仍有血管擴(kuò)張和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，程度較I/R組稍有減輕(Fig 1C);PGE142 μg·L－1組心肌纖維腫脹，但少有斷裂，間質(zhì)血管擴(kuò)張不明顯，有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(Fig 1D);PGE1126 μg·L－1組心肌纖維腫脹明顯減輕，無斷裂，偶見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，形態(tài)近似于C組(Fig 1E)。

2.2 PGE1預(yù)處理對(duì)大鼠缺血/再灌注損傷心肌PKC的影響PKC在I/R組的表達(dá)(0.383±0.013)較C組(0.220±0.003)增加。與I/R組相比較，PGE1預(yù)處理組PKC的表達(dá)量亦明顯增加(P＜0.05)，且各預(yù)處理組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，F(xiàn)ig 2，Tab 1。

2.3 PGE1預(yù)處理對(duì)大鼠缺血/再灌注損傷心肌HSP70的影響I/R組HSP70的陽性表達(dá)較C組(2.36±0.18)明顯增多(P ＜0.05)。PGE1預(yù)處理組HSP70的表達(dá)量較I/R組增加更明顯(P＜0.05)，且各預(yù)處理組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見 Tab 1。

Fig 2 Effects of PEG1on PKC in ischemia/reperfusion preconditioning myocytes

Tab 1 Effects of PGE1on PKC and HSP70 in ischemia/reperfusion preconditioning myocytes(±s，n=8)

Tab 1 Effects of PGE1on PKC and HSP70 in ischemia/reperfusion preconditioning myocytes(±s，n=8)

*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs I/R;△P ＜0.05 vs PGE114 μg·L－1;□P ＜0.05 vs PGE142 μg·L－1

Group PKC/β-actin Percent of positive area on HSP70/%Control 0.220 ±0.003 2.36 ±0.18 I/R 0.383 ±0.013* 4.90 ±0.56*PGE114 μg·L －1 0.456 ±0.006*# 7.18 ±0.29*#PGE142 μg·L －1 0.640 ±0.017*#△ 11.15 ±0.23*#△PGE1126 μg·L －1 0.822 ±0.008*#△□ 16.88 ±0.34*#△□

3 討論

預(yù)適應(yīng)指預(yù)先給與某種損傷性刺激后，機(jī)體組織器官對(duì)這些有害刺激產(chǎn)生的耐受性或適應(yīng)性［5］。經(jīng)過預(yù)適應(yīng)的心肌能夠縮小心肌梗死的面積，保護(hù)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮和心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，降低再灌注所導(dǎo)致的心律失常的發(fā)生率，使心肌從再灌注誘導(dǎo)的心肌頓抑中恢復(fù)［6－7］。缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)作為損傷應(yīng)激過程存在實(shí)施損傷性預(yù)適應(yīng)的倫理學(xué)障礙或方法上的困難，隨著學(xué)者們有益的探索，以藥物代替缺血刺激即藥理性預(yù)適應(yīng)，以模擬或激發(fā)機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)而誘導(dǎo)心肌保護(hù)作用在心血管領(lǐng)域中備受關(guān)注。

目前，諸多研究認(rèn)為PKC的激活是IPC的共同通路。給與PKC激動(dòng)劑PMA預(yù)處理后能明顯減輕心肌細(xì)胞缺氧性凋亡，提示PKC參與抗心肌細(xì)胞缺氧性凋亡，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞［8］。HSP70廣泛存在于微生物到哺乳動(dòng)物中，有高度保守性［9］，可發(fā)揮分子伴侶功能，保護(hù)新合成蛋白質(zhì)的恰當(dāng)構(gòu)型，防止/修復(fù)應(yīng)激所致的蛋白質(zhì)損傷，以保護(hù)細(xì)胞功能和生存［10］。HSP70作為IPC中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的效應(yīng)因子之一，可保護(hù)心肌收縮力，減少心肌缺血壞死范圍，發(fā)揮抗心律失常作用。李文兵［11］等研究表明，瑞芬太尼預(yù)處理可增強(qiáng)犬急性MIRI早期心肌組織HSP70的表達(dá)，對(duì)MIRI的心肌具有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)采用Langendorff裝置制備離體MIRI模型，以排除神經(jīng)激素、前后負(fù)荷和心率的影響，結(jié)果表明:PGE1可明顯改善MIRI后心肌纖維形態(tài)變化，促進(jìn)PKC和HSP70的表達(dá)，其可能機(jī)制是PGE1作用于相應(yīng)受體后，經(jīng)IP3/DAG信號(hào)通路激活PKC，進(jìn)而調(diào)控HSP70的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其分子伴侶功能，提高細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)能力，抵抗應(yīng)激所致?lián)p傷，以保護(hù)MIRI細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。目前有關(guān)于PGE1的研究多集中于氧自由基、心肌酶和細(xì)胞凋亡，而對(duì)于PGE1在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的研究較少，尚有待于進(jìn)一步探討。

［1］ Hide E J，Ney P，Piper J，et al.Reduction by prostaglandin E1or prostaglandin E0of myocardial infarct size in the rabbit by activation of ATP-sensitive potassium channels［J］.Br J Pharmacol，1995，116(5)，2435 －40.

［2］ 馬香芹，馮國(guó)清，付潤(rùn)芳，等.前列腺素E1對(duì)缺氧復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2004，20(3):303－7.

［2］ Ma X Q，F(xiàn)eng G Q，F(xiàn)u R F，et al.Effects of prostaglandin E1on hypoxia/reoxygenation apoptosis in cultured neonatal rat cardiomyocytes［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(3):303 －7.

［3］ 楊 光，張沈麗，胡永校，等.前列腺素E1對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞ATP敏感K+通道的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2001，17(3):326－8.

［3］ Yang G，Zhang S L，Hu Y X，et al.Effect of prostaglandine E1on ATP-sensitive K+channel in ventricular myocytes of guinea pig［J］.Chin Pharmacol Bull，2001，17(3):326 －8.

［4］ 葉萍仙，朱建華，夏 強(qiáng).脂質(zhì)體攜載前列腺素E1抗心肌缺血/再灌注損傷［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2001，17(3):302 －5.

［4］ Ye P X，Zhu J H，Xia Q.Effects of liposomal prostaglandin E1against myocardial reperfusion injury in rabbits［J］.Chin Pharmacol Bull，2001，17(3):302 －5.

［5］ Pasqualin R C，Auer J O Jr.Myocardial protection by pre-and post-anesthetic conditioning［J］.Rev Bras Anestesiol，2008，58(5):512 －9，506 －12.

［6］ Hao J，Kim H S，Choi W，et al.Mechanical stretch-induced protection against myocardial ischemia-reperfusion injury involves AMP-activated protein kinase［J］.Korean J Physiol Pharmacol，2010，14(1):1－9.

［7］ de Groot P C，Thijssen D H，Sanchez M，et al.Thijssen，Manuel Sanchez.Ischemic preconditioning improves maximal performance in humans［J］.Eur J Appl Physiol，2010，108(1):141 － 6.

［8］ 李 洪，楊天德，陶 軍，等.蛋白激酶C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在缺氧性心肌細(xì)胞凋亡中的作用［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2003，32(8):973－86.

［8］ Li H，Yang T D，Tao J，et al.The role of protein kinase C signal transduction in apoptosis of cardiomyocytes induced by hypoxia［J］.Chongqing Medical J，2003，32(8):973 － 86.

［9］ 馬 波，張建軍，劉耕陶.熱休克蛋白與神經(jīng)保護(hù)［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(8):984 －7.

［9］ Ma B，Zhang J J，Liu G T.Hsp70 and neuroprotection［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(8):984 －7.

［10］解麗君，張建新，李蘭芳.異丙酚對(duì)離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷后細(xì)胞凋亡及HSP70表達(dá)的影響［J］.中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2007，27(3):236 －9.

［10］ Xie L J，Zhang J X，Li L F.Effects of propofol on cardiomyocytes apoptosis and expression of HSP70 protein induced by ischemia/reperfusion injury in isolated rat hearts［J］.Chin J Crit Care Med，2007，27(3):236 －9.

［11］李文兵，劉寶江.瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)犬急性心肌缺血/再灌注早期血清H-FABP和心肌組織NF-κB、HSP70的影響［D］.山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008.

［11］ Li W B，Liu B J.Effects of remifentanil preconditioning on the content of H-FABP in serum and NF-κB，HSP70 in the cardiac muscle tissue of canines with myocardial ischemia reperfusion injury［D］.The Master's Degree Thesis Shanxi Med Univ，2008.