趙雪強(qiáng)，王績(jī)英，王昌明，莫碧文，蔣 明，陳 峰

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西桂林 541001)

肺癌是最常見和最難治的腫瘤之一，大多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已是肺癌晚期，以綜合治療為主，但對(duì)放、化療不敏感，可能是與腫瘤耐藥性有關(guān)。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是新發(fā)現(xiàn)的TNF超家族成員，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用而對(duì)機(jī)體正常組織不具有明顯的毒性作用［1－2］。但研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株對(duì)TRAIL高度耐藥。三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)是傳統(tǒng)中藥砒石的主要成分，已用于白血病的治療，有學(xué)者認(rèn)為還具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用。采用RT-PCR法檢測(cè)Caspase-3、Survivin mRNA在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)，并探討As2O3增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;TRAIL購(gòu)自以色列Prospec公司，批號(hào):207HTRAIL01;As2O3即亞砷酸氯化鈉注射液購(gòu)自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)公司，批號(hào):20090203;MTT購(gòu)自美國(guó)Amresco;RNA提取試劑盒TRIzol Reagent Kit購(gòu)自TaKaRa公司;RT-PCR System購(gòu)自TaKaRa公司，引物由上海生工合成，引物序列如下:Survivin sense為5'-CCC TTT CTC AAG GAC CAC CGC ATC-3'，anti-sense為 5'-GCC AAG TCT GGC TCG TTC TCA GTG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為133 bp;Caspase-3 sense為5'-TTG GAA CAA ATG GAC CTG TTG ACC TG-3'，anti-sense 為 5'-GGA CTC AAA TTC TGT TGC CAC CTT TC-3'擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為365 bp;Human actin beta sense為5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3'，anti-sense 為 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為243 bp。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自存。在5%CO237℃條件下，于10%胎牛血清、100 U·ml－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)液中傳代，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3 MTT比色法檢測(cè)藥物體外抗瘤作用將生長(zhǎng)活力良好的A549細(xì)胞以每孔4 000的數(shù)目加入96孔板，待細(xì)胞貼壁后分別加入 6.25、12.5、25、50、100、200 μmol·L－1的 As2O3以及 0.1、1、10、100 μmol·L－1的 As2O3聯(lián)合 TRAIL(100 μg·L－1)，每濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照(僅加培養(yǎng)液)。培養(yǎng) 48 h 后，每孔加 5 g·L－1的 MTT20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加 DMSO 200 μl，震蕩 5 min，使沉淀充分溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm吸光度(A)值。分別計(jì)算As2O3組和聯(lián)合用藥組IC50值。

采用兩藥相互作用系數(shù)(coefficient of drug in inter-action，CDI)評(píng)價(jià)兩藥相互作用。CDI按下列公式計(jì)算:CDI=AB/A×B。吸光度值進(jìn)行計(jì)算，AB是兩藥聯(lián)合組與對(duì)照組的比值，A、B是各藥單獨(dú)使用組與對(duì)照組的比值。如CDI＜1，證明兩藥作用性質(zhì)為協(xié)同。

1.4 流式細(xì)胞儀PI染色觀察細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板中，每孔4×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)12 h后，用含0.5%胎牛血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞周期同步化。后分別加入 0、1、10 μmol·L－1As2O3以及分別與100 μg·L－1TRAIL 聯(lián)用，每濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞，70%冷乙醇固定，4℃過夜，檢測(cè)前用PBS洗去固定液，加入20 μl RNaseA，37 ℃孵育 30 min，暗處加PI染液，冰浴30 min，以300目篩網(wǎng)過濾。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109·L－1后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)光源為氬離子，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，用Multicycle DNA分析軟件行細(xì)胞凋亡率測(cè)定。

1.5 RT-PCR 檢測(cè) Survivin、Caspase-3 mRNA 的表達(dá)按“1.4”中藥物濃度干預(yù)細(xì)胞48 h后，提取總RNA?？俁NA提取按TaKaRa公司提供的試劑操作步驟操作。AMV第一鏈cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再經(jīng)PCR擴(kuò)增。Survivin擴(kuò)增條件如下:94 ℃、3 min;94 ℃、15 s，61 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35個(gè)循環(huán);72℃、5 min。Caspase-3擴(kuò)增條件如下:94 ℃、3 min;94 ℃、15 s，61 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35個(gè)循環(huán);72℃、5 min。PCR產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)分析，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量(與β-actin的比值)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用±s表示。用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法測(cè)定對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響單用 As2O3組 IC50值為 42.1 μmol·L－1，聯(lián)合用藥組 IC50值為7.21 μmol·L－1。經(jīng)計(jì)算低濃度聯(lián)合組CDI值為0.99＜1，高濃度聯(lián)合組CDI值為0.94＜1。因此，As2O3具有協(xié)同TRAIL對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷作用。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡與對(duì)照組相比，As2O31、10 μmol·L－1作用 48h 后均能誘導(dǎo) A549細(xì)胞凋亡(P ＜0.05);TRAIL 100 μg·L－1則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，與單獨(dú)用藥組相比，TRAIL和As2O310 μmol·L－1聯(lián)合用藥組 A549 細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.01)。結(jié)果見Tab 1。

Tab 1 The A549 cells apoptotic ratio of each group(±s，n=3)

Tab 1 The A549 cells apoptotic ratio of each group(±s，n=3)

*P ＜0.05 vs control，△P ＜0.05 vs 1 μmol·L－1As2O3;##P ＜0.01 vs 10 μmol·L －1As2O3

Group Apoptotic ratio/%Control 0.62 ±0.20 TRAIL 100 μg·L －1 5.92 ±2.48 As2O31 μmol·L －1 13.23 ±1.99*As2O310 μmol·L －1 24.70 ±1.68*As2O31 μmol·L－1+TRAIL 100 μg·L －1 28.73 ±1.55△As2O310 μmol·L －1+TRAIL 100 μg·L －1 48.97 ±9.22##

2.3 藥物對(duì)A549細(xì)胞Survivin、Caspase-3 mRNA的表達(dá)的影響RT-PCR檢測(cè) Survivin、Caspase-3 mRNA的表達(dá)情況見Fig 1、2，結(jié)果表明A549細(xì)胞經(jīng)As2O3、TRAIL用藥48 h后Survivin mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05);與單用藥組相比，As2O3聯(lián)合TRAIL用藥48h后Survivin mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)。與對(duì)照組相比，單用As2O3Caspase-3 mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，而單用TRAIL48h后則影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與單用藥組相比，聯(lián)合用藥組作用48 h后Caspase-3 mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。

Fig 1 The expression of Survivin in different groups.

Fig 2 The expression of Caspase-3 in different groups.

3 討論

多藥耐藥(mutidrug resistance，MDR)是影響腫瘤化療效果的重要原因。MDR的機(jī)制仍然沒有完全清楚，目前認(rèn)為是由于MDR1基因編碼的蛋白、MRP基因編碼的MRP1使細(xì)胞內(nèi)的化療藥排出或分布異常，使細(xì)胞內(nèi)達(dá)不到有效藥物濃度［3－4］。但這一機(jī)制還不能完全闡明多藥耐藥。有研究表明，MDR與細(xì)胞凋亡有關(guān)。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白，具有調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡作用。研究發(fā)現(xiàn)Survivin和肺癌的耐藥性與疾病預(yù)后有關(guān)［5－7］。

As2O3是中藥砒石的有效成分，可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生長(zhǎng)，還可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的耐藥性［8－10］。但 As2O3不是 P-gp的有效作用底物［11］。Hopkins-Donaldson 等［12］研究結(jié)果顯示，多數(shù)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株對(duì)TRAIL高度耐藥。基于此，對(duì) As2O3與TRAIL聯(lián)用在抑制A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的作用進(jìn)行研究。

對(duì)As2O3和TRAIL作用于A549的研究中發(fā)現(xiàn)，As2O3和TRAIL對(duì)肺癌A549細(xì)胞均具有一定的抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。兩者聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞具有協(xié)同抗腫瘤作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力明顯高于單用時(shí)的作用。TRAIL通過與其細(xì)胞表面的死亡受體結(jié)合是啟動(dòng)凋亡的關(guān)鍵步驟，因此死亡受體表達(dá)量的改變將影響TRAIL的抗腫瘤作用，可能也是部分腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL耐藥的原因之一，化療藥物上調(diào)死亡受體表達(dá)從而逆轉(zhuǎn)耐藥［13］。但凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示As2O3聯(lián)合TRAIL用藥作用48h后均較單用藥組Survivin mRNA的表達(dá)明顯降低，Caspase-3 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，并且具有濃度依賴性。

以上結(jié)果表明，As2O3通過下調(diào)Survivin，解除對(duì)凋亡通路的抑制，上調(diào)Caspase-3表達(dá)，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。這可能是As2O3增強(qiáng)TRAIL對(duì)A549細(xì)胞殺傷作用的機(jī)制之一。同時(shí)As2O3具有內(nèi)在的腫瘤殺傷活性。這將為臨床應(yīng)用As2O3與TRAIL治療肺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝:桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心為實(shí)驗(yàn)提供良好的科研條件和大力支持)

［1］ Pan G，O'Rourke K，Chinnaiyan A M，et al.The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL［J］.Science，1997，276(5309):111 －3.

［2］ Aggarwal B B，Bhardwaj U，Takada Y.Regulation of TRAIL-induced apoptosis by ectopic expression of antiapoptotic factors［J］.Vitam Horm，2004，67:453－83.

［3］ O'Connor R.The pharmacology of cancer resistance［J］.Antican-cer Res，2007，27(3A):1267 －72.

［4］ Chen CJ，Clark D，Ueda K，et al.Genomic organization of the human multidrug resistance(MDR1)gene and origin of P-glycoproteins［J］.J Biol Chem，1990，265(1):506 －14.

［5］ Yang H，F(xiàn)u JH，Hu Y，et al.Influence of siRNA targeting survivin on chemosensitivity of H460/cDDP lung cancer cells［J］.J Int Med Res，2008，36(4):734 －47.

［6］ Derin D，Soydinc H O，Guney N，et al.Serum levels of apoptosis biomarkers，survivin and TNF-alpha in nonsmall cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2008，59(2):240 －5.

［7］ Yang C T，Li J M，Weng H H，et al.Adenovirus-mediated transfer of siRNA against survivin enhances the radiosensitivity of human non-small cell lung cancer cells［J］.Cancer Gene Ther，2010，17(2):120 －30.

［8］ 馮覺平，孔慶志，黃 濤，等.三氧化二砷對(duì)肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/R耐藥性的影響［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2006，23(2):201－3.

［8］ Feng J P，Kong Q Z，Huang T，et al.Effect of arsenic trioxide on drug resistance in drug-resistance human lung adenocarcinoma cell line A549/R［J］.Chin J Exp Surg，2006，23(2):201 －3.

［9］ 邢 茂，張恩娟，葉 鑫.三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡途徑的研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2002，18(1):87－90.

［9］ Xing M，Zhang E J，Ye X.Investigation of the pathway of apoptosis induced by arsenic trioxide in cancer cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2002，18(1):87 －90.

［10］張 莉，王 玲，宋維華，等.三氧化二砷通過升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度介導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2004，20(8):867－70.

［10］ Zhang L，Wang L，Song W H，et al.Apoptosis of human pulmonary adenocarcinoma cells mediated by arsenic trioxide via increasing intracellular calcium concentration［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(8):867 －70.

［11］ Ling Y H，Jiang J D，Holland J F，et al.Arsenic trioxide produces polymerization of microtubules and mitotic arrest before apoptosis in human tumor cell lines［J］.Mol Pharmacol，2002，62(3):529－38.

［12］ Hopkins-Donaldson S，Ziegler A，Kurtz S，et al.Silencing of death receptor and caspase-8 expression in small cell lung carcinoma cell lines and tumors by DNA methylation［J］.Cell Death Differ，2003，10(3):356 －64.

［13］呂雄文，李 俊，靳 弟，等.TRAIL及其受體在咖啡因抑制肝癌細(xì)胞系 HepG2增殖中的作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(5):619 －24.

［13］ Lü X W，Li J，Jin D，et al.The role of TRAIL and its receptors in the inhibitory effect of caffeine on the proliferation of hepatocellular carcinoma cell line HepG2［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(5):619－24.