晏烽根，李慶林

(省部共建新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230038)

新藤黃酸是從中藥藤黃中提取分離出來(lái)的有效成分，我們實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)新藤黃酸體內(nèi)外抗腫瘤作用進(jìn)行了初步探討，表明新藤黃酸能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，包括人結(jié)腸癌細(xì)胞 HT-29、人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人白血病細(xì)胞K562等，并能誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549凋亡［1］。而在鼻咽癌的研究中已有藥物能誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，例如高三尖杉酯堿和茶中多酚類物質(zhì)EGCG等報(bào)道［2－3］。但新藤黃酸對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-1的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本文進(jìn)行了這方面研究。

1 材料與方法

1.1 材料藥物:新藤黃酸(純度:≥99.0%;批號(hào):20090314)為安徽中醫(yī)學(xué)院自制;抗體β-actin、Cytochrome C、p38、ERK1/2 購(gòu)自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)公司;Caspase-3 購(gòu)自Bioworld(Bioworld Technology，MN，USA);p-p38、p-ERK1/2購(gòu)自Cell Signaling(Cell Signaling Technology，MA，USA)公司;Western blot和其他試劑來(lái)自Abcam(Cambridge，MA，USA)或者 Sigma-Aldrich(Saint Louis，MO，USA)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞CNE-1購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞菌種庫(kù)(ATCC)，細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。并于37℃，5%CO2條件下恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化選取CNE-1細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期接種于6孔板，并貼壁培養(yǎng)過(guò)夜。各實(shí)驗(yàn)組按要求給予新藤黃酸不同濃度和時(shí)間的藥液加藥處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)control組，處理完后在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)CNE-1細(xì)胞用胰酶消化并稀釋約為1×106·L－1的活細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔180 μl，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，貼壁過(guò)夜后加不同濃度的新藤黃酸藥液20 μl，使其終濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 和 8.0 μmol·L－1，control組加入20 μl完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同時(shí)間(24、48和72 h)，每孔加入5.0 g·L－1的 MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h 后，小心吸棄全部上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩后，用酶標(biāo)儀(570 nm)記錄各孔的吸光度(OD)，細(xì)胞存活率/%=處理組OD/對(duì)照組(control)OD×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CNE-1細(xì)胞凋亡率采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-1細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過(guò)夜后棄去原來(lái)培養(yǎng)基，加入2.0 μmol·L－1新藤黃酸后繼續(xù)培養(yǎng)，control組則換用完全培養(yǎng)基。作用不同時(shí)間后，用0.25%胰酶消化細(xì)胞(不含EDTANa)，各組樣本細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×106～5×106·L－1，2 000 r·min－1離心5 min 棄去培養(yǎng)液。PBS 洗滌 2 次，2 000 r·min－1離心 5 min。加入 400 μl緩沖液重懸細(xì)胞。加入5 μl AnnexinⅤ混勻后再加入5 μl PI混勻。室溫下避光孵育15 min。1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 觀察CNE-1細(xì)胞凋亡形態(tài)細(xì)胞接種于6孔板，過(guò)夜貼壁培養(yǎng)后再加新藤黃酸處理24 h，control組加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。胰酶消化后收集細(xì)胞，PBS洗兩遍，用戊二醛固定，電鏡觀察并細(xì)胞攝片。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白變化CNE-1細(xì)胞在2.0 μmol·L－1新藤黃酸不同時(shí)間作用后用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。10%～15%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行SDSPAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)。再5%脫脂奶粉封閉，4℃一抗孵育過(guò)夜。PBST洗滌3次，每次10 min。再加HRP標(biāo)記的二抗稀釋液溫育2 h，PBST洗滌3次，每次10 min。用ECL進(jìn)行顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用Prism 5.0 software(Graph Pad software，San Diego，USA)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 新藤黃酸抑制CNE-1細(xì)胞生長(zhǎng)在不同的濃度和不同時(shí)間經(jīng)過(guò)新藤黃酸處理CNE-1細(xì)胞后進(jìn)行顯微鏡觀察，可以看出在不同濃度新藤黃酸作用于CNE-1細(xì)胞24 h后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞固縮變圓，體積變小，少量細(xì)胞貼壁不牢，呈半貼壁狀態(tài)，尤其在高濃度(4.0、8.0 μmol·L－1)CNE-1 細(xì)胞多數(shù)固縮變圓，較多細(xì)胞脫落，漂浮于培養(yǎng)液中(Fig 1A)。在 2.0 μmol·L－1新藤黃酸作用 CNE-1細(xì)胞，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)CNE-1細(xì)胞也出現(xiàn)細(xì)胞貼壁不牢，細(xì)胞數(shù)目減少，作用細(xì)胞48 h后，細(xì)胞基本脫落，碎裂并漂浮于培養(yǎng)液中(Fig 1B)。

2.2 新藤黃酸抑制CNE-1細(xì)胞的增殖MTT法檢測(cè)表明，在 0.25 ～8.0 μmol·L－1濃度范圍內(nèi)的新藤黃酸處理人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞24、48和72 h后，與control組比較，各給藥組細(xì)胞存活率降低(P＜0.05或P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 2)。

2.3 新藤黃酸誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞凋亡2.0 μmol·L－1新藤黃酸作用24 h后可見(jiàn)大約50%的CNE-1細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且隨著作用時(shí)間增加細(xì)胞凋亡率也隨之上升(Fig 3)。該作用通過(guò)透射電子顯微鏡得到了進(jìn)一步的證實(shí)，電鏡下細(xì)胞出現(xiàn)胞體皺縮變圓、胞質(zhì)凝縮，細(xì)胞質(zhì)失水濃縮，細(xì)胞核發(fā)生典型核染色質(zhì)固縮、核碎裂成碎片等現(xiàn)象(Fig 4B)，其中可以觀察到與control組相比新藤黃酸對(duì)線粒體的損傷，包括線粒體膜的破裂、腫脹(Fig 4D)，而正常線粒體形態(tài)正常，嵴清晰完整，排列整齊(Fig 4C)。這些結(jié)果顯示，新藤黃酸能誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞凋亡。

Fig 1 A Morphological observation of Gambogenic acid inhibiting CNE-1 cells growth and viability by inverted microscope(×200)

Fig 2 Effects of Gambogenic acid on the viability of CNE-1 cells

Fig 3 Gambogenic acid-induced apoptosis rate in CNE-1 cells by flow cytometry

2.4 新藤黃酸影響CNE-1細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)在新藤黃酸2.0 μmol·L－1不同時(shí)間作用下CNE-1細(xì)胞內(nèi)Cytochrome C和Caspase-3蛋白隨著時(shí)間的增加蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)時(shí)間依賴的增加(Fig 5)，為進(jìn)一步探究新藤黃酸誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，還檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi) p38、ERK1/2、p-p38、p-ERK1/2 的蛋白表達(dá)情況，該結(jié)果表明在2.0 μmol·L－1新藤黃酸處理后p-p38在短時(shí)間內(nèi)被激活(Fig 6A)，p-ERK1/2蛋白表達(dá)則呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的減少(Fig 6)，而蛋白p38和ERK1/2的表達(dá)水平基本不變(Fig 6B)。

3 討論

鼻咽癌的高發(fā)地區(qū)包括東南亞，還有北極地區(qū)的原住民，以及北非阿拉伯人和中東部分地區(qū)，尤其是在中國(guó)的廣東省的中部［4］。而且兒童和成人鼻咽癌5年的存活率大約60%［5］。目前，鼻咽癌的治療主要是依靠化學(xué)療法和放射療法或者兩者相結(jié)合，新藤黃酸作為一種天然的植物提取物，具有前景的抗腫瘤藥物，并具有抗癌譜廣、毒性低特點(diǎn)，前期實(shí)驗(yàn)也表明新藤黃酸可以抑制結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌細(xì)胞增殖［6］，已經(jīng)越來(lái)越引起人們的關(guān)注。

Fig 4 Morphologic features of apoptosis analysis by transmission electron microscopy

Fig 5 Gambogenic acid increased expression of Cytochrome C and Caspase-3

Fig 6 Gambogenic acid effect on p-p38 and p-ERK1/2 protein expression A:120 min，B:36 h

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)新藤黃酸在不時(shí)間和濃度下能抑制CNE-1細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其凋亡機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑相關(guān)，通過(guò)電鏡可以觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)發(fā)生變化，并出現(xiàn)了線粒體膜通透性改變，線粒體膜受損。而且Western blot實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)到Cytochrome C和Caspase-3隨著時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白表達(dá)量依賴性的增加。也有其他文獻(xiàn)報(bào)道誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡通過(guò)線粒體信號(hào)途徑［7］，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類似。

MAPK家族在鼻咽癌抗腫瘤活性中起著重要的作用，越來(lái)越多的報(bào)道表明MAPK家族成員在鼻咽癌的研究中具有重要的生物活性［8－9］。p-ERK1/2和p-p38MAPK是MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路中是重要的調(diào)控蛋白，對(duì)調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡具有極其重要的作用［10－11］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:新藤黃酸處理CNE-1細(xì)胞后，p38、ERK1/2蛋白基本沒(méi)有變化，pp38在短時(shí)間內(nèi)被激活，p-ERK1/2則呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的表達(dá)減少。這些蛋白的變化可能參與了新藤黃酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

許多抗腫瘤藥物都可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤生長(zhǎng)和增殖的主要機(jī)制之一，最近有報(bào)道表明［12－13］誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可用于腫瘤的治療。本實(shí)驗(yàn)研究了新藤黃酸誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能涉及線粒體凋亡途徑，并且MAPK系統(tǒng)也參與凋亡進(jìn)程中。希望本實(shí)驗(yàn)機(jī)制的探討能為新藤黃酸開(kāi)發(fā)為臨床抗腫瘤藥物提供參考價(jià)值和科學(xué)依據(jù)。

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