潘凌云， 徐　敏， 王　億， 修彥鳳*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心，上海201203）

?

UPLC-ESI-MS/MS法分析藤黃炮制前后化學(xué)成分的變化

潘凌云1，2， 徐敏1， 王億1， 修彥鳳1*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心，上海201203）

摘要：目的 建立超高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-ESI-MS/MS）法研究藤黃Garcinia hanburyi炮制（高壓、豆腐、清水、荷葉制）前后化學(xué)成分的變化。方法 分析采用Acquity UPLCBEH C8（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.1％甲酸溶液，梯度洗脫；柱溫為35℃；體積流量為0.3 mL/min。主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別（PLS-DA）法分析炮制前后化學(xué)成分的差異。結(jié)果 炮制前后，藤黃中化學(xué)成分的種類沒有明顯變化。當(dāng)加熱超過2 h，以及豆腐或荷葉炮制后，13種成分的含有量下降，并且gambogenin更為明顯。不同炮制方法間存在差異，貢獻(xiàn)值依次為gambogenin、莫里林酸、異莫里林酸、R-異藤黃酸、R-30-羥甲基藤黃酸、成分5（未知）、異新藤黃酸、S-30-羥甲基藤黃酸、isogambogenin、S-異藤黃酸、R-藤黃酸、新藤黃酸、S-藤黃酸。結(jié)論 不同炮制方法和加熱時(shí)間對(duì)藤黃化學(xué)成分有一定影響，其含有量的降低可能是該植物炮制后減毒的原因之一。

關(guān)鍵詞：藤黃；炮制；化學(xué)成分；UPLC-ESI-MS/MS；PCA；PLS-DA

KEY WORDS：Garcinia hanburyi；processing；chemical constituents；UPLC-ESI-MS/MS；PCA；PLS-DA.

藤黃為藤黃科植物藤黃Garcinia hanburyi Hook.f.所分泌的膠質(zhì)樹脂。有大毒，對(duì)局部組織有較強(qiáng)的刺激性，內(nèi)服后可刺激胃壁神經(jīng)和腸黏膜，使胃部分泌物增多，腸蠕動(dòng)亢進(jìn)，膽汁增加。劑量較大時(shí)，可引起胃腸炎甚至腸出血等［1］。藤黃經(jīng)炮制后，其毒性均有不同程度的下降［2-4］，內(nèi)服應(yīng)用必須要經(jīng)過炮制。90年代，葉定江課題組采用薄層掃描法與高效液相色譜法測(cè)定藤黃及其炮制品中藤黃酸和新藤黃酸的含有量，結(jié)果表明炮制前后化學(xué)成分未發(fā)生明顯變化［5-7］。近年來對(duì)于藤黃的研究主要集中在其抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究，對(duì)于藤黃炮制過程的物質(zhì)基礎(chǔ)變化未見進(jìn)一步的研究，其炮制減毒機(jī)理的研究也未見報(bào)道。為了開展藤黃炮制減毒機(jī)理的研究，本課題采用超高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-ESI-MS/MS）法測(cè)定了不同炮制方法（高壓制、豆腐制、清水制和荷葉制）和不同加熱炮制時(shí)間的藤黃炮制品，探討藤黃炮制前后化學(xué)成分發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化，為深入探究其炮制減毒機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 儀器 Waters Acquity超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；API5500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）；SB-3200D超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；Sartorius CP225D電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；01J2003-04立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海東亞壓力容器制造有限公司）。

1.2 材料 5批生藤黃樣品（S1～S5）分別購自亳州市百洲堂電子有限公司、亳州市華礁商貿(mào)有限公司、亳州市藥材市場(chǎng)、上海童涵春堂中藥飲片廠和上海市藥材公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)丁文平教授鑒定為藤黃科植物藤黃Garcinia hanburyi Hook.f.所分泌的膠質(zhì)樹脂。藤黃酸（批號(hào)T0434）、新藤黃酸（批號(hào)X0435）購自上海順勃生物工程技術(shù)有限公司，含有量≥98％；五味子甲素（批號(hào)110764-200408）購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；清美老豆腐購自上海聯(lián)華超市；荷葉購自上海養(yǎng)和堂藥店。乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藤黃不同炮制品的制備［8］

2.1.1 生藤黃 將5份原藥材揀去雜質(zhì)，研細(xì)，過24目篩，編號(hào)S1～S5。

2.1.2 高壓制藤黃 分別取生藤黃粗粉5份，每份20 g，置于蒸發(fā)皿中，高壓蒸鍋0.12 MPa下蒸制0.5、1、2、3 h，取出，低溫干燥，研細(xì)，過24目篩，即得。

2.1.3 豆腐制藤黃 將豆腐塊平鋪于瓷盤內(nèi)，分別取生藤黃粗粉5份，每份50 g，置于500 g豆腐上，再覆蓋另一層豆腐，常壓蒸1、2、3、4 h，至藤黃全部溶化后取出，冷卻凝固，除去豆腐，低溫干燥，研細(xì)，過24目篩，即得。

2.1.4 清水制藤黃 分別取生藤黃粗粉5份，每份50 g，放入燒杯內(nèi)，加10倍量水煮沸，濾過，不斷攪拌，中途添加沸水，連續(xù)煮0.5、1、2、3、5 h，濃縮至糊狀，取出，低溫干燥，研細(xì)，過24目篩，即得。

2.1.5 荷葉制藤黃 取50 g荷葉，分別加入10、8倍量水煎煮2次，時(shí)間分別為30、20 min，濾過，合并濾液，濃縮得到荷葉汁（0.1 g/mL），取500 mL，分別加入生藤黃粗粉5份，每份50 g，煮至烊化，并繼續(xù)濃縮至稠膏狀，取出，低溫干燥，研細(xì)，過24目篩，即得。

2.2 樣品溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取藤黃酸、新藤黃酸5.0 mg，五味子甲素2.5 mg，置于5 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻，即得。臨用前，用流動(dòng)相稀釋。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取藤黃不同炮制品（生品、高壓、豆腐、清水、荷葉制）細(xì)粉0.05 g，置于離心管中，精密加入甲醇5 mL，密塞，稱定重量，超聲10 min（功率180 W、頻率40 kHz），放冷，甲醇補(bǔ)足減失重量，離心5 min （5 000 r/min），精密吸取上清液0.1 mL，加入內(nèi)標(biāo)五味子甲素（0.5 mg/mL）0.1 mL，甲醇稀釋定容至10 mL。再精密吸取上清液50 μL，甲醇稀釋定容至5 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

2.3.1 液相色譜條件 色譜柱Acquity UPLC BEH C8色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1％甲酸水溶液（B）；梯度洗脫（0→8.5 min，70％A；8.5→9.5 min，90％A；9.5→10 min，70％A）；柱溫為35℃；體積流量為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式；離子源噴霧電壓5.5 kV；離子源氣簾氣241.3 kPa；碰撞氣48.3 kPa；離子源溫度500℃；霧化氣413.7 kPa；輔助氣413.7 kPa；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。

2.4 藤黃不同炮制品的UPLC-ESI-MS/MS分析取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品和藤黃不同炮制品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法分析。參考文獻(xiàn)［9-11］，選取m/z分別為561、631、615、629、645的準(zhǔn)分子離子，再結(jié)合MS2的主要碎片離子作為離子對(duì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，得到13個(gè)化合物的色譜峰。參考對(duì)照品藤黃酸、新藤黃酸設(shè)定的質(zhì)譜參數(shù)，進(jìn)一步優(yōu)化其他各化合物的碰撞能量（CE）、去簇電壓（DP）、碰撞室出口電壓（CXP），UPLC-ESI-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式圖見圖1。通過質(zhì)譜分析，得到各化合物在正離子模式下的色譜圖，通過與對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息進(jìn)行對(duì)照（圖1A），再結(jié)合文獻(xiàn)［9-11］，最終推斷出了12個(gè)色譜峰所對(duì)應(yīng)的化合物，結(jié)果見表1。

1.異莫里林酸 2.莫里林酸 3.異新藤黃酸 4.新藤黃酸 5～7.未知、isogambogenin、gambogenin 8.R-異藤黃酸9.S-異藤黃酸 10.R-藤黃酸 11.S-藤黃酸 12.R-30-羥甲基藤黃酸 13.S-30-羥甲基藤黃酸 14.五味子甲素1.isomorellic acid 2.morellic acid 3.isogambogenic acid 4.gambogenic acid 5-7.unknown，isogambogenin and gambogenin 8.R-isogambogic acid 9.S-isogambogic acid 10.R-gambogic acid 11.S-gambogic acid 12.R-30-hydroxygambogic acid 13.S-30-hydroxygambogic acid 14.deoxyschizandrin圖1　多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.1 M ultip le reaction monitoring（MRM）chromatogram s

2.5 數(shù)據(jù)分析

2.5.1 藤黃加熱炮制前后化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化將藤黃不同成分的色譜峰面積除以內(nèi)標(biāo)物五味子甲素的對(duì)應(yīng)峰面積，即得到每個(gè)色譜峰的相對(duì)峰面積，以消除前處理及測(cè)定過程中出現(xiàn)的誤差。將5批藤黃炮制品與生藤黃的相對(duì)峰面積平均值進(jìn)行比較，結(jié)果見表2，13種成分在不同藤黃炮制品中的變化見圖2。

由表2、圖2可知，高壓制0.5～1 h后，藤黃中g(shù)ambogenin含有量降低，其他成分變化不大；2 h后，其含有量降低，而其他成分明顯增加；3 h后，各成分含有量均降低。豆腐制藤黃1～2 h后，除gambogenin含有量降低外，其他成分變化不大；3～4 h后，各成分含有量均降低。清水制藤黃1～3 h后，除gambogenin含有量明顯降低外，大部分成分略有降低；煮至5 h時(shí)，13種成分含有量均降低。荷葉制藤黃后，各成分含有量均降低。

表1　分析數(shù)據(jù)及化學(xué)成分Tab.1 Analysis data and chem ical constituents

表2　相對(duì)峰面積比值Tab.2 Ratios of relative peaK areas

圖2　各成分在不同樣品中的變化趨勢(shì)Fig.2 Changing trends of various constituents in different sam ples

綜上所述，gambogenin在所有炮制品中的含有量均降低。炮制時(shí)間對(duì)炮制品中成分的含有量有影響，隨高壓、豆腐、清水制加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，大部分成分的含有量先增加后減少，加熱時(shí)間大于2 h后，各成分含有量明顯減少。由圖2可知，gambogenin含有量降低較明顯，其他成分變化趨勢(shì)基本一致。

2.5.2 主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA） 采用SIMCA-P11.0軟件，對(duì)不同炮制方法的13種成分相對(duì)峰面積進(jìn)行主成分分析（PCA），結(jié)果見圖3。然后，通過偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）的VIP值來篩選炮制前后變化顯著的化學(xué)標(biāo)志物。

圖3　PCA得分圖Fig.3 PCA score plot

由圖可知，生藤黃與炮制品2（高壓制0.5 h）、3（高壓制1 h）、10（清水制0.5 h）、11（清水制1 h）、12（清水制2 h）、13（清水制3 h）位置接近，而其他炮制品分別分布在不同區(qū)域。4（高壓制2 h）、5（高壓制3 h）、14（清水制5 h）、15（荷葉制）、6（豆腐制1 h）、7（豆腐制2 h）、8（豆腐制3 h）、9（豆腐制4 h）差別明顯，表明加熱時(shí)間大于2 h后，高壓、清水、荷葉炮制品與生品有明顯差異；豆腐制時(shí)間越長(zhǎng)，其炮制品與生品差異越大，說明炮制時(shí)間和輔料豆腐對(duì)藤黃中的化學(xué)成分有一定影響。

然后，采用常用變量重要性投影VIP值來描述變量的貢獻(xiàn)程度。經(jīng)PLS-DA分析得到VIP值，由大到小依次為gambogenin >2 >1 >8 >12 >成分5（未知）>3 >13 >isogambogenin >9 >10 >4 >11，見表1。即gambogenin >莫里林酸>異莫里林酸>R-異藤黃酸>R-30-羥甲基藤黃酸>成分5（未知）>異新藤黃酸>S-30-羥甲基藤黃酸>isogambogenin > S-異藤黃酸>R-藤黃酸>新藤黃酸>S-藤黃酸。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-ESI-MS/MS法，分析了藤黃生品及其高壓、豆腐、清水、荷葉炮制品中的化學(xué)成分，對(duì)其中13種成分的相對(duì)峰面積進(jìn)行了PCA 和PLS-DA分析，發(fā)現(xiàn)藤黃加熱炮制后，成分的種類沒有明顯變化；加熱時(shí)間超過2 h，以及加豆腐或荷葉炮制后，各成分含有量變化明顯，既包括含有量較高的藤黃酸和新藤黃酸等，也包括含有量較低的成分5（未知）、isogambogenin、gambogenin、R-30-羥甲基藤黃酸和S-30-羥甲基藤黃酸等。

通過比較不同炮制品與生藤黃的相對(duì)峰面積比值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加熱時(shí)間大于2 h并進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)，大部分化學(xué)成分的含有量降低，與是否加輔料關(guān)系不大，孔令東等［8，12］報(bào)道，炮制時(shí)間為5 h時(shí)，藤黃的毒性降低，推測(cè)炮制后成分含有量的降低可能是其炮制減毒的原因之一。

藤黃因其毒性及炮制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)問題而不能迅速推廣，仍不在《中國(guó)藥典》2015年版收載范圍之列。因歷史原因，藤黃各種炮制方法所用的輔料類型、輔料量、加熱時(shí)間、炮制程度等差別較大，解毒程度亦不一致，從而一定程度上限制了其現(xiàn)代臨床應(yīng)用［13］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，是否加輔料對(duì)藤黃中的大多成分影響不大，隨著炮制加熱時(shí)間延長(zhǎng)而呈降低趨勢(shì)，但加熱時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)藤黃藥理作用的影響未有深入研究。藤黃采用何種方法進(jìn)行炮制，以及炮制時(shí)間多長(zhǎng)比較合適，需要結(jié)合藥效及毒理學(xué)進(jìn)行研究，以規(guī)范藤黃的炮制方法和工藝參數(shù)，保證質(zhì)量穩(wěn)定，為擴(kuò)大其在中醫(yī)臨床上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

在優(yōu)選內(nèi)標(biāo)成分時(shí)，曾試用熊果酸、齊墩果酸，發(fā)現(xiàn)兩者更適合負(fù)離子模式出峰，而樣品中化合物在正離子模式下響應(yīng)更高；試用地西泮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素時(shí)，在所選的色譜條件下出峰時(shí)間均較早；五味子甲素穩(wěn)定性好、響應(yīng)強(qiáng)、色譜保留時(shí)間適合、無干擾，因此選擇其作為內(nèi)標(biāo)。在優(yōu)化UPLC-MS/MS測(cè)定方法時(shí)，曾用Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），但R-藤黃酸與S-藤黃酸的分離效果及峰形較差，改用C8色譜柱后，不僅改善了分離度，而且縮短了分析時(shí)間。

化合物5～7通過其一、二級(jí)質(zhì)譜信息，結(jié)合文獻(xiàn)［9-10］，推斷其中兩個(gè)成分為isogambogenin 和gambogenin，而另一成分有待用其他質(zhì)譜及NMR手段作進(jìn)一步確認(rèn)。

對(duì)化合物6、7進(jìn)行MS/MS掃描分析，在相同碰撞能量下，發(fā)現(xiàn)兩者的主要子離子都有m/z491，m/z463，m/z367，通過其一、二質(zhì)譜信息及保留時(shí)間結(jié)合文獻(xiàn)參考［9-10］，推斷化合物6、7分別為isogambogenin和gambogenin。對(duì)化合物5進(jìn)行MS/MS掃描分析，在相同碰撞能量下，發(fā)現(xiàn)主要子離子有m/z491（m/z615分子失去了-C9H16及m/z435，但未出現(xiàn)m/z463及m/z 367，推測(cè)化合物5結(jié)構(gòu)與化合物6、7相似，其具體結(jié)構(gòu)有待用其他質(zhì)譜及NMR手段進(jìn)一步確認(rèn)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 孟昭泉，宋大慶，苑修太.實(shí)用急性中毒急救［M］.濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，2009：687.

［2］ 龔千鋒.中藥炮制學(xué)［M］.第3版.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2012：354.

［3］ 沈海葆，葉定江，蔡寶昌，等.藤黃不同炮制品小鼠半數(shù)致死量的測(cè)定和比較［J］.江蘇中醫(yī)，1995，16（12）：41-42.

［4］ 竇 娟，文紅梅，郁紅禮，等.藤黃炮制品對(duì)大鼠腸道組織病理學(xué)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（5）：279-282.

［5］ 葉定江，吳 皓，胡 永，等.藤黃及其炮制品中藤黃酸的含量比較［J］.中國(guó)中藥雜志，1995，20（10）：601.

［6］ 郭 戎，葉定江，俞 璉，等.炮制對(duì)藤黃中藤黃酸含量的影響［J］.中成藥，1994，16（6）：23-24.

［7］ 劉幸平，郭 戎，葉定江，等.炮制對(duì)藤黃中新藤黃酸含量的影響［J］.中成藥，1996，18（3）：17-18.

［8］ 王愛芳，華衛(wèi)國(guó)，吳隘敏.藤黃炮制工藝的初步研究［J］.中成藥，1988（9）：20-21.

［9］ 周 安，李慶林，彭代銀，等.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定中藥藤黃中橋環(huán)類化合物［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43 （8）：838-842.

［10］ Zhou Y，Liu X，Yang J，et al.Analysis of caged xanthones from the resin of Garcinia hanburyi using ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionization quadrupole time-offlight tandem mass spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2008，629（1-2）：104-118.

［11］ Yang J，Ding L，Hu L L，etal.Rapid characterization of caged xanthones in the resin of Garcinia hanburyi usingmultiplemass spectrometric scanning modes：The importance of biosynthetic knowledge based prediction［J］.J pharm Biomed Anal，2012，60：71-79.

［12］ 孔令東，葉定江，王蘇玲，等.藤黃炮制品急性毒性及抗炎作用的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，1996，21（4）：214-216.

［13］ 張慧芳.淺談不同炮制方法對(duì)藤黃的影響［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2008，29（10）：73-74.

Variations of chem ical constituents in Garcinia hanburyi before and after processing by UPLC-ESI-MS/MS

PAN Ling-yun1，2， XU Min1， WANG Yi1， XIU Yan-feng1*
（1.College of pharmacy，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China；2.ExPeriment Center for Science and Technology，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

ABSTRACT：AIM To establish an ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry（UPLC-ESI-MS/MS）method for studying the variations of chemical constituents in Garcinia hanburyi before and after being processed with high pressure，tofu，water and lotus leaf.METHODS The analysis was performed on an Acquity UPLC BEH C8column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），mobile phase was acetonitrile -0.1％formic acid solution with gradient elution，column temperaturewasmaintained at35℃，and flow ratewas 0.3 mL/min.Principal component analysis（PCA）and partial least squared discriminant analysis（PLS-DA）were adopted to analyze the differences in chemical constituents before and after processing.RESULTS Before and after processing，the kinds of chemical constituents in Garcinia hanburyi did not show obvious change.After being heated formore than two hours and being processed with tofu or lotus leaf，the contents of thirteen constituentswere decreased，especially for gambogenin.There were some differences among different processing methods，and the contribution valueswere in sequence of gambogenin >morellic acid >isomorellic acid >R-isogambogic acid >R-30-hydroxygambogic acid >compound 5（unknown）>isogambogenic acid >S-30-hydroxygambogic acid >isogambogenin >S-isogambogic acid >R-gambogic acid >gambogenic acid >S-gambogic acid.CONCLUSION Different processingmethods and heating time have effects on chemical constituents in Garcinia hanburyi，and the decrease of their contentsmay be one of the reasons for toxicity attenuation after processing.

*通信作者：修彥鳳（1974—），女，副教授，從事中藥炮制及制劑研究。E-mail：xiuyf@hotmail.com

作者簡(jiǎn)介：潘凌云（1989—），男，碩士生，從事中藥炮制及制劑研究。Tel：（021）51322393，E-mail：kelley007@163.com

基金項(xiàng)目：上海市自然基金項(xiàng)目（13ZR1442000）；上海市教委預(yù)算內(nèi)課題資助項(xiàng)目（2014YSN20）

收稿日期：2015-10-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.028

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1098-06