劉海楠，李生瑩，楊宇平，楊錦南

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng) 453003)

百草枯(paraquat，PQ)又名對(duì)草快、克蕪蹤，化學(xué)名是1，1'-二甲基-4，4'-聯(lián)吡啶二氯化物，是目前使用較廣泛的除草劑之一，其中毒事件屢有發(fā)生，口服致死率高達(dá)60%～80%。PQ中毒常可導(dǎo)致肺、心、肝、腎等多臟器損害，也有報(bào)道顯示眼睛被污染后會(huì)引起嚴(yán)重結(jié)膜炎或永久性角膜混濁［1］，可致人視力嚴(yán)重下降。此外，國(guó)外有研究［2］表明玻璃體腔內(nèi)注射一定劑量的百草枯可誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜損傷，國(guó)內(nèi)尚未見百草枯對(duì)視網(wǎng)膜損傷的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察Bcl-2和Bax在百草枯誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜損傷中的表達(dá)，探討百草枯損傷視網(wǎng)膜的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑① 動(dòng)物:健康無眼疾成年SD大鼠30只，體質(zhì)量180～200 g，♀♂各半，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(豫)2005-0001;② 主要藥品與試劑:百草枯(No 50920)購(gòu)于 Sigma公司，臨用前用 0.1 mol·L－1PBS配制成所需濃度;TUNEL凋亡試劑盒(No 11684817910)購(gòu)于德國(guó) Roche Applied Science公司;蛋白酶 K(No 11175529)購(gòu)于德國(guó) Roche Applied Science公司;DAB顯色試劑盒(No K96712H)購(gòu)于北京中杉公司;β-actin、Bax、Bcl-2小鼠抗大鼠單克隆抗體(sc-47778、sc-7480、sc-7382)購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司;③ 主要儀器設(shè)備:Anke.TGL-16GA低溫離心機(jī)購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠;電泳儀購(gòu)于美國(guó)Bio-rad公司;DYCZ-40B型轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于北京六一廠。

1.2 分組與造模30只SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為正常對(duì)照組、不同時(shí)間點(diǎn)(12 h、1 d、2 d、5 d)PQ組。正常對(duì)照組大鼠玻璃體腔內(nèi)注射0.1 mol·L－1PBS溶液，PQ組雙眼玻璃體腔內(nèi)各注射 4 mmol·L－1的百草枯溶液 2 μl，分別在給藥后12 h、1 d、2 d、5 d 處死動(dòng)物，摘除雙側(cè)眼球。左眼置于混合固定液中固定，右眼摘除后立即分離視網(wǎng)膜，分別提取各組樣本視網(wǎng)膜總蛋白［3］。

1.3 HE染色摘除左眼后，立即放入混合固定液［4］中固定3 h，之后放入體積分?jǐn)?shù)為0.10的中性甲醛固定過夜，開窗，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，縱向視網(wǎng)膜切片，厚5 μm，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察病理形態(tài)的改變。

1.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡按照凋亡試劑盒說明書要求進(jìn)行操作，陰性對(duì)照不加TDT酶，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，在顯微鏡(×400)下觀察，正常細(xì)胞核為藍(lán)色，凋亡陽性細(xì)胞核為棕黃色。400倍鏡下自視盤旁開始向鋸齒緣方向連續(xù)取4個(gè)視野，記錄每個(gè)視野中TUNEL陽性細(xì)胞核數(shù)和視網(wǎng)膜細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。即AI/%=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 Western blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜中 Bcl-2，Bax的表達(dá)提取視網(wǎng)膜總蛋白:剝離視網(wǎng)膜于勻漿器中，加入蛋白裂解液冰上勻漿裂解，低溫離心后取上清。Bradford法測(cè)定蛋白濃度。加Loading buffer水浴煮沸5 min進(jìn)行蛋白變性，SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，封閉結(jié)束后將PVDF膜與適當(dāng)濃度的一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，常溫二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL試劑盒檢測(cè)，顯影定影水洗晾干。將晾干的X光片掃描后用Quantity One分析軟件進(jìn)行光密度值分析，以目的條帶與內(nèi)參β-actin的比值作為半定量依據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組數(shù)據(jù)的差異用one-way ANOVA法，每?jī)山M之間的比較用Scheffe法。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜HE染色正常對(duì)照組視網(wǎng)膜細(xì)胞各層排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常;12 h PQ組外核層細(xì)胞核排列出現(xiàn)輕微紊亂，其它各層細(xì)胞排列正常;1 d PQ組可在內(nèi)核層、外核層觀察到少量核固縮，外核層表現(xiàn)出疏松紊亂;2 d PQ組內(nèi)核層觀察到大量核固縮，內(nèi)核層被嚴(yán)重破壞，外核層明顯紊亂，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞開始出現(xiàn)核固縮;5 d PQ組視網(wǎng)膜細(xì)胞被嚴(yán)重破壞，內(nèi)外核層稀疏嚴(yán)重紊亂，幾乎看不到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Fig 1)。

2.2 TUNEL法檢測(cè)結(jié)果正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜各層中均未檢測(cè)到凋亡陽性細(xì)胞;12 h PQ組在外核層可觀察到少量的陽性細(xì)胞;1 d PQ組內(nèi)核層開始出現(xiàn)大量的陽性凋亡細(xì)胞，外核層和其他層可見少量陽性細(xì)胞，2 d PQ組凋亡細(xì)胞指數(shù)達(dá)到高峰;5 d時(shí)陽性細(xì)胞與1 d、2 d時(shí)相比有所減少(Fig 2)。

2.3 Western blot結(jié)果玻璃體腔注射百草枯后12 h時(shí)，Bcl-2蛋白表達(dá)表現(xiàn)出升高趨勢(shì)，Bcl-2在1 d時(shí)表達(dá)水平最高，與正常對(duì)照組相比(P＜0.01)，2 d時(shí)開始下降，5 d時(shí)基本恢復(fù)正常水平;Bax在12 h時(shí)蛋白表達(dá)明顯比正常組高(P＜0.01)，在2 d時(shí)達(dá)到最高水平，5 d時(shí)表達(dá)開始減少，PQ模型組與正常對(duì)照組相比均較高(P＜0.01);Bcl-2/Bax在12 h時(shí)比正常對(duì)照組降低(P＜0.01)，2 d時(shí)比值最低，到5 d時(shí)比值開始升高(Fig 3，Tab 2)。

3 討論

Fig 1 HE staining(×400) A:Normal control;B:12 h after PQ intravitreal injection;C:1 d after PQ intravitreal injection;D:2 d after PQ intravitreal injection;E:5 d after PQ intravitreal injection

Fig 2 Detection of apoptosis in retinal cells by TUNEL(×400)

Fig 3 The effect on expression of Bcl-2 and Bax proteins after PQ intravitreal injection by Western blot

Tab 1 The apoptotic rate of cells in PQ models(%，±s，n=6)

Tab 1 The apoptotic rate of cells in PQ models(%，±s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs NC，△△P ＜0.01 vs 2 d

Group Apoptotic rate NC 0.00 ±0.00△△12 h 5.57 ±1.43＊＊△△1 d 10.35 ±1.13＊＊2 d 12.80 ±1.15＊＊5 d 8.13 ±1.33＊＊△△

Tab 2 The effect on expression of Bcl-2 and Bax proteins after PQ intravitreal injection by Western blot(±s)

Tab 2 The effect on expression of Bcl-2 and Bax proteins after PQ intravitreal injection by Western blot(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NC

GROUP Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax NC 1.00 ±0.031 0.84 ±0.031 1.19 ±0.02 12 h 1.02 ±0.021 1.15 ±0.029＊＊ 0.88 ±0.026＊＊1 d 1.27 ±0.032＊＊ 1.48 ±0.026＊＊ 0.85 ±0.017＊＊2 d 1.10 ±0.026* 2.13 ±0.040＊＊ 0.51 ±0.006＊＊5 d 1.01 ±0.026 1.30 ±0.021＊＊ 0.77 ±0.015＊＊

百草枯(paraquat，PQ)是一種非選擇性除草劑，可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)。有報(bào)道［5］某些神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病與長(zhǎng)時(shí)間低劑量暴露于PQ密切相關(guān)。由于百草枯對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)，可使體外的色素上皮細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生凋亡［2，6］。

細(xì)胞凋亡是許多眼部疾病的共同特征，如視網(wǎng)膜色素變性、視網(wǎng)膜剝離、青光眼等。其中Bcl-2家族基因在細(xì)胞凋亡過程中起到重要的作用，Bcl-2是一原癌基因，通過編碼蛋白Bcl-2發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的功能。Bax是Bcl-2家族蛋白中的一員，發(fā)揮促進(jìn)凋亡的作用。Bcl-2和Bax通過自身組成同二聚體和彼此之間組成異二聚體的不同比例介導(dǎo)其對(duì)細(xì)胞存活的生物學(xué)效應(yīng)，通過調(diào)控線粒體外膜通透性，控制體內(nèi)凋亡因子和細(xì)胞色素C等的釋放從而調(diào)控細(xì)胞是否存活。

有研究表明［7］，光感受器細(xì)胞的凋亡可以誘發(fā)Bcl-2的下調(diào)和Bax的上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組中Bcl-2和Bax的表達(dá)處于相對(duì)平衡的狀態(tài)，模型組12 h時(shí)Bax開始升高，Bcl-2也開始升高，Bcl-2自身可形成同二聚體，也可與Bax形成異二聚體發(fā)揮抗凋亡作用，Bax可自身形成同源二聚體發(fā)揮促進(jìn)凋亡的作用［8－9］，Bcl-2/Bax 值的降低，可能使細(xì)胞開始向著凋亡的方向發(fā)展，與觀察到Fig 1B外核層排列開始紊亂，F(xiàn)ig 2B外核層有少量的凋亡細(xì)胞檢出相符。1 d時(shí)Bcl-2繼續(xù)升高并達(dá)到高峰，在該時(shí)間點(diǎn)Bcl-2可能通過阻止或降解細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮和DNA裂解的發(fā)生來抵抗視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡，過度表達(dá)后可抑制鈣超載、氧自由基、興奮性氨基酸等誘發(fā)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡［10］，Bax表達(dá)量在該時(shí)間點(diǎn)也達(dá)到一定的高度，Bcl-2/Bax比值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，同時(shí)TUNEL觀察該時(shí)間的凋亡細(xì)胞表達(dá)升高，Bax的高表達(dá)對(duì)于該時(shí)期的細(xì)胞凋亡有著重要的意義。Bax在2 d時(shí)達(dá)到高峰，而Bcl-2表達(dá)量開始降低，Bcl-2/Bax在2 d時(shí)達(dá)到最低，2 d組的凋亡指數(shù)在該時(shí)期達(dá)到高峰，這可能是由于Bax表達(dá)特別高，使形成的Bax同二聚體較多，促使了2 d時(shí)的視網(wǎng)膜細(xì)胞大量的凋亡，也有可能是Bcl-2家族的其他分子和一些抗凋亡因子、誘導(dǎo)因子的綜合調(diào)節(jié)形成的結(jié)果，隨著Bax表達(dá)量在5 d時(shí)減少，我們看到TUNEL檢出的陽性細(xì)胞數(shù)也減少。

綜上所述，TUNEL凋亡的陽性表達(dá)和Bcl-2、Bax的表達(dá)是密切相關(guān)的。表明了百草枯誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷中Bcl-2、Bax兩種蛋白起到了重要的作用，同時(shí)Bcl-2/Bax在一定程度上可以反映凋亡的趨勢(shì)，為以后視網(wǎng)膜色素變性的臨床治療研究提供了基礎(chǔ)。百草枯誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷更詳細(xì)的機(jī)制，需要我們進(jìn)行更深入的研究。

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