王 蕊，楊大宇 ，許貴軍，高宏偉，呂邵娃

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) a.北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.附屬第二醫(yī)院；c.附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040）

中藥藤黃為藤黃科植物藤黃Garcinia hanburyi Hook.f.的樹(shù)脂[1]。主產(chǎn)于印度、柬埔寨、泰國(guó)等地區(qū)[2]，是一味名貴的進(jìn)口藥材。其具有很強(qiáng)的消癥散結(jié)、化瘀止痛的作用，常以外用法給藥?！毒V目拾遺》記載其治癰疽，止血化毒，斂金瘡，亦能殺蟲(chóng)?！霸诏煵　b疽、燙傷、跌打損傷、金掩腫痛、換血凝結(jié)、疔腫”等方面療效顯著，內(nèi)服可做致瀉劑。然而，生藤黃有大毒，主要毒性成分為藤黃酸、新藤黃酸等，也是其有效成分?，F(xiàn)代藥理研究，藤黃酸主要有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用[3]。藤黃酸的不良反應(yīng)主要是注射部位出現(xiàn)血管刺激、腹痛和惡心等[4]。目前，為了降低其毒性，一方面采用不同炮制方法，另一方面嚴(yán)格控制生藤黃入藥劑量。然而，目前，市場(chǎng)上藤黃制劑中藤黃酸的含量并不明確。為此，本文采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定含藤黃不同制劑中藤黃酸的含量，建立一種穩(wěn)定可靠、方法和操作簡(jiǎn)單的測(cè)定藤黃酸的含量方法，為藤黃在新藥劑型研發(fā)和質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)，為含藤黃不同制劑的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供科學(xué)資料。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀；梅特勒AB265-S天平（Mettler-Toledo Group）；SB-5200D 型超聲波清洗機(jī)（200W，40kHz），R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）。

1.2 試藥

藤黃（購(gòu)于安因市振宇中藥材飲片有限公司,經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室孫慧峰教授鑒定）；含藤黃外用制劑市售（批號(hào)：20180410，201805 21，20180618，20190306，20190716）；實(shí)驗(yàn)室自制貼膏；藤黃酸對(duì)照品（批號(hào)：wkq18031911，純度≥98%四川省維克奇生物科技有限公司）；H3PO4（批號(hào)：2018 0110天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（批號(hào)：1903071西隴科學(xué)股份有限公司）；乙腈（色譜純河北百靈威精細(xì)材料有限公司）；水為哇哈哈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

ULtimat XB-C18色譜柱（250mm×4.6mm,5μm），流動(dòng)相乙腈-0.1%H3PO4水溶液（9 4∶6），流速1.0mL·min－1，測(cè)波長(zhǎng) 361nm，理論板數(shù)按藤黃酸計(jì)不低于4000，與相鄰峰分離度大于1.5，柱溫30℃，進(jìn)樣量 10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取藤黃酸對(duì)照品2.002mg，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，即得藤黃酸對(duì)照品照品貯備溶液。

2.2.2 含藤黃外用制劑溶液的制備 取本品內(nèi)容物[5]，取約 2g，加硅藻土 3g，研勻，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率25QW，頻率33kHz）30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇溶液稀釋置刻度，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)室自制貼膏溶液的制備 取本品一貼剪碎，置燒杯中攪拌混勻，精密稱(chēng)定4g，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇45mL，稱(chēng)定重量，加熱回流30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取上清液，旋干，加甲醇溶液定容置25mL容量瓶中，作為供試品母液，從供試品母液中精密吸取1mL，置50mL容量瓶中，加甲醇溶液稀釋置刻度，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 藤黃酊[6]供試品溶液 將藤黃30個(gè)研碎成粉,浸泡于95%酒精70mL中,配成略帶粘稠之藤黃酊。精密吸取藤黃酊10μL，置100mL容量瓶中，加甲醇溶液稀釋置刻度，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.5 藤鋅散供試品溶液 取藤黃細(xì)粉30g,鋅氧粉70g,攪拌混勻，制成藤鋅散，外用。精密稱(chēng)定藤鋅散0.5g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率 25W，頻率 33kHz）30min，放冷,再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾1mL，置25mL容量瓶中，加甲醇溶液稀釋置刻度，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

以實(shí)驗(yàn)室自制貼膏的陰性對(duì)照溶液在上述色譜條件下，吸取溶液10μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，溶液色譜中在與藤黃酸保留時(shí)間相同的位置處無(wú)干擾峰。專(zhuān)屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 藤黃酸含量測(cè)定圖Fig.1 Determination of gambogic acid content

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取藤黃酸對(duì)照品，加甲醇制成濃度為0.4000mg·mL-1的儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋成系列濃度的對(duì)照 品 溶 液 使 濃 度 分 別 為 0.2000、0.1000、0.0500、0.0250、0.0125mg·mL-1置棕色量瓶中，精密吸取上述各對(duì)照品溶液10μL，注入液相色譜儀，將數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，得回歸方程為y=124.43x-0.4229，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，結(jié)果表明藤黃酸在0.1250～0.2000μg線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，見(jiàn)圖2。

圖2 藤黃酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of Gambogic acid

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，藤黃酸峰面積的RSD分別為0.12%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度考察結(jié)果Tab.1 Precision inspection results

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述 4 種供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，12h，依上述色譜條件進(jìn)樣10μL，計(jì)算藤黃酸的RSD為0.21%～2.35%范圍內(nèi)，表明4種供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab.2 Stability inspection results

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取上述4種藤黃外用制劑，按2.2項(xiàng)下供試品制備方法制得供試品溶液（n=6），測(cè)定其中藤黃酸的RSD在1.05%～1.59%之間，表明該方法重復(fù)性良好，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)考察結(jié)果Tab.3 Repeated test investigation results

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的含藤黃外用制劑、實(shí)驗(yàn)室自制貼膏、藤黃酊、藤鋅散各6份，精密稱(chēng)定分別加入適量的對(duì)照品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表，藤黃酸的平均回收率（n=6）分別為99.97%，99.45%，98.39%，99.68%；RSD分別為1.96%，1.07%，1.46%，0.14%。

表4 加樣回收率結(jié)果Tab.4 Sample recovery results

2.9 含藤黃不同外用制劑中藤黃酸的含量

取含藤黃外用制劑、實(shí)驗(yàn)室自制貼膏、藤黃酊、藤鋅散，按2.2項(xiàng)下方法分別制備四種供試品溶液，按2.1的色譜條件測(cè)定藤黃酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 含藤黃不同外用制劑中藤黃酸的含量（n=6）Tab.5 Contents of gambogic acid in different external preparations containing Garcinia cambogia（n=6）

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

本文考察甲醇-水、乙腈-水溶液、乙腈-0.1%乙酸水、乙腈-0.1%H3PO4水溶液作為流動(dòng)相，乙腈-0.1%H3PO4水溶液作為流動(dòng)相時(shí)分離度良好，峰型無(wú)拖尾[6]。當(dāng)乙腈比例低于94%時(shí)，藤黃酸及其異構(gòu)體的色譜峰分離，裂開(kāi)，出現(xiàn)肩峰，藤黃酸沒(méi)有完全分離，最終選擇乙腈-0.1%H3PO4水溶液（94∶6）洗脫條件，藤黃酸分離度良好，峰形對(duì)稱(chēng)，保留時(shí)間適中，無(wú)雜峰干擾，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可靠。藤黃酸的全波長(zhǎng)掃描最大吸收波長(zhǎng)為361nm，該檢測(cè)波長(zhǎng)下分離度好，其他雜峰干擾小，能滿(mǎn)足測(cè)定要求。

3.2 穩(wěn)定性考察

對(duì)藤黃酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行穩(wěn)定性考察時(shí)，因藤黃酸結(jié)構(gòu)含多個(gè)酚羥基，很容易被氧化[1]，對(duì)照品放置12h后，發(fā)現(xiàn)藤黃酸不穩(wěn)定，其后出現(xiàn)了一個(gè)小峰，同時(shí)含量降低，所以在配制標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，以免藤黃酸在空氣中暴露太久，被氧化變質(zhì)。

3.3 提取和分離方法的選擇

除回流提取方法本實(shí)驗(yàn)還考察了另外一種提取方法超聲提取方法，結(jié)果顯示回流提取法和超聲提取法含量無(wú)顯著性差異，但由于供試品中含有黏稠性基質(zhì)，超聲提取無(wú)法除去黏稠成分，進(jìn)樣時(shí)易吸附在色譜柱上，沖洗柱子不方便，對(duì)色譜柱傷害較大，所以本實(shí)驗(yàn)最終選擇回流提取法。

3.4 進(jìn)樣量的選擇

分別考察了 5、10、20、30μL 進(jìn)樣量，發(fā)現(xiàn) 20 和30μL時(shí)由于濃度過(guò)大分離度不好，藤黃酸及其同分異構(gòu)體分不開(kāi)，進(jìn)樣量10μL時(shí)峰易分開(kāi)，沒(méi)有肩峰現(xiàn)象，重現(xiàn)性也良好。

3.5 柱溫的選擇

本實(shí)驗(yàn)曾考察25、30℃兩種柱溫，柱溫影響并不大，但考慮到耐用性等問(wèn)題選擇用30℃為柱溫。

4 結(jié)論

本研究以藤黃酸為指標(biāo)，對(duì)藤黃的古方外用制劑藤黃酊與藤鋅散和現(xiàn)代醫(yī)院制劑含藤黃外用制劑與實(shí)驗(yàn)室自制制劑的質(zhì)量控制進(jìn)行研究，結(jié)果表明所建立的方法簡(jiǎn)便快速，穩(wěn)定可靠，能有效控制藤黃酸的使用量，用于該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)，以此為藤黃外用制劑的質(zhì)量控制提供了科學(xué)可靠的依據(jù)。