王 蕊,楊大宇 ,許貴軍,高宏偉,呂邵娃
(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) a.北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b.附屬第二醫(yī)院;c.附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)
中藥藤黃為藤黃科植物藤黃Garcinia hanburyi Hook.f.的樹(shù)脂[1]。主產(chǎn)于印度、柬埔寨、泰國(guó)等地區(qū)[2],是一味名貴的進(jìn)口藥材。其具有很強(qiáng)的消癥散結(jié)、化瘀止痛的作用,常以外用法給藥?!毒V目拾遺》記載其治癰疽,止血化毒,斂金瘡,亦能殺蟲(chóng)?!霸诏煵 b疽、燙傷、跌打損傷、金掩腫痛、換血凝結(jié)、疔腫”等方面療效顯著,內(nèi)服可做致瀉劑。然而,生藤黃有大毒,主要毒性成分為藤黃酸、新藤黃酸等,也是其有效成分?,F(xiàn)代藥理研究,藤黃酸主要有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用[3]。藤黃酸的不良反應(yīng)主要是注射部位出現(xiàn)血管刺激、腹痛和惡心等[4]。目前,為了降低其毒性,一方面采用不同炮制方法,另一方面嚴(yán)格控制生藤黃入藥劑量。然而,目前,市場(chǎng)上藤黃制劑中藤黃酸的含量并不明確。為此,本文采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定含藤黃不同制劑中藤黃酸的含量,建立一種穩(wěn)定可靠、方法和操作簡(jiǎn)單的測(cè)定藤黃酸的含量方法,為藤黃在新藥劑型研發(fā)和質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ),為含藤黃不同制劑的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供科學(xué)資料。
Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀;梅特勒AB265-S天平(Mettler-Toledo Group);SB-5200D 型超聲波清洗機(jī)(200W,40kHz),R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)。
藤黃(購(gòu)于安因市振宇中藥材飲片有限公司,經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室孫慧峰教授鑒定);含藤黃外用制劑市售(批號(hào):20180410,201805 21,20180618,20190306,20190716);實(shí)驗(yàn)室自制貼膏;藤黃酸對(duì)照品(批號(hào):wkq18031911,純度≥98%四川省維克奇生物科技有限公司);H3PO4(批號(hào):2018 0110天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);甲醇(批號(hào):1903071西隴科學(xué)股份有限公司);乙腈(色譜純河北百靈威精細(xì)材料有限公司);水為哇哈哈水,其他試劑均為分析純。
ULtimat XB-C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相乙腈-0.1%H3PO4水溶液(9 4∶6),流速1.0mL·min-1,測(cè)波長(zhǎng) 361nm,理論板數(shù)按藤黃酸計(jì)不低于4000,與相鄰峰分離度大于1.5,柱溫30℃,進(jìn)樣量 10μL。
2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取藤黃酸對(duì)照品2.002mg,置10 mL棕色量瓶中,加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,0.22μm微孔濾膜過(guò)濾,即得藤黃酸對(duì)照品照品貯備溶液。
2.2.2 含藤黃外用制劑溶液的制備 取本品內(nèi)容物[5],取約 2g,加硅藻土 3g,研勻,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25mL,稱(chēng)定重量,超聲處理(功率25QW,頻率33kHz)30min,放冷,再稱(chēng)定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過(guò)濾,精密量取續(xù)濾1mL,置10mL容量瓶中,加甲醇溶液稀釋置刻度,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾,即得。
2.2.3 實(shí)驗(yàn)室自制貼膏溶液的制備 取本品一貼剪碎,置燒杯中攪拌混勻,精密稱(chēng)定4g,置圓底燒瓶中,精密加入甲醇45mL,稱(chēng)定重量,加熱回流30min,放冷,再稱(chēng)定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,離心,取上清液,旋干,加甲醇溶液定容置25mL容量瓶中,作為供試品母液,從供試品母液中精密吸取1mL,置50mL容量瓶中,加甲醇溶液稀釋置刻度,0.22μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。
2.2.4 藤黃酊[6]供試品溶液 將藤黃30個(gè)研碎成粉,浸泡于95%酒精70mL中,配成略帶粘稠之藤黃酊。精密吸取藤黃酊10μL,置100mL容量瓶中,加甲醇溶液稀釋置刻度,搖勻,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾,即得。
2.2.5 藤鋅散供試品溶液 取藤黃細(xì)粉30g,鋅氧粉70g,攪拌混勻,制成藤鋅散,外用。精密稱(chēng)定藤鋅散0.5g,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25mL,稱(chēng)定重量,超聲處理(功率 25W,頻率 33kHz)30min,放冷,再稱(chēng)定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過(guò)濾,精密量取續(xù)濾1mL,置25mL容量瓶中,加甲醇溶液稀釋置刻度,搖勻,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾,即得。
以實(shí)驗(yàn)室自制貼膏的陰性對(duì)照溶液在上述色譜條件下,吸取溶液10μL進(jìn)樣,記錄色譜圖,溶液色譜中在與藤黃酸保留時(shí)間相同的位置處無(wú)干擾峰。專(zhuān)屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 藤黃酸含量測(cè)定圖Fig.1 Determination of gambogic acid content
精密量取藤黃酸對(duì)照品,加甲醇制成濃度為0.4000mg·mL-1的儲(chǔ)備液,逐級(jí)稀釋成系列濃度的對(duì)照 品 溶 液 使 濃 度 分 別 為 0.2000、0.1000、0.0500、0.0250、0.0125mg·mL-1置棕色量瓶中,精密吸取上述各對(duì)照品溶液10μL,注入液相色譜儀,將數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸,以峰面積為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo),得回歸方程為y=124.43x-0.4229,相關(guān)系數(shù)R2=0.9998,結(jié)果表明藤黃酸在0.1250~0.2000μg線性范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,見(jiàn)圖2。
圖2 藤黃酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of Gambogic acid
取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液,進(jìn)樣10μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,藤黃酸峰面積的RSD分別為0.12%,結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 精密度考察結(jié)果Tab.1 Precision inspection results
取上述 4 種供試品溶液,分別于 0,2,4,6,8,12h,依上述色譜條件進(jìn)樣10μL,計(jì)算藤黃酸的RSD為0.21%~2.35%范圍內(nèi),表明4種供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好,結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab.2 Stability inspection results
取上述4種藤黃外用制劑,按2.2項(xiàng)下供試品制備方法制得供試品溶液(n=6),測(cè)定其中藤黃酸的RSD在1.05%~1.59%之間,表明該方法重復(fù)性良好,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 重復(fù)性試驗(yàn)考察結(jié)果Tab.3 Repeated test investigation results
取已知含量的含藤黃外用制劑、實(shí)驗(yàn)室自制貼膏、藤黃酊、藤鋅散各6份,精密稱(chēng)定分別加入適量的對(duì)照品,按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表,藤黃酸的平均回收率(n=6)分別為99.97%,99.45%,98.39%,99.68%;RSD分別為1.96%,1.07%,1.46%,0.14%。
表4 加樣回收率結(jié)果Tab.4 Sample recovery results
取含藤黃外用制劑、實(shí)驗(yàn)室自制貼膏、藤黃酊、藤鋅散,按2.2項(xiàng)下方法分別制備四種供試品溶液,按2.1的色譜條件測(cè)定藤黃酸的含量,結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 含藤黃不同外用制劑中藤黃酸的含量(n=6)Tab.5 Contents of gambogic acid in different external preparations containing Garcinia cambogia(n=6)
本文考察甲醇-水、乙腈-水溶液、乙腈-0.1%乙酸水、乙腈-0.1%H3PO4水溶液作為流動(dòng)相,乙腈-0.1%H3PO4水溶液作為流動(dòng)相時(shí)分離度良好,峰型無(wú)拖尾[6]。當(dāng)乙腈比例低于94%時(shí),藤黃酸及其異構(gòu)體的色譜峰分離,裂開(kāi),出現(xiàn)肩峰,藤黃酸沒(méi)有完全分離,最終選擇乙腈-0.1%H3PO4水溶液(94∶6)洗脫條件,藤黃酸分離度良好,峰形對(duì)稱(chēng),保留時(shí)間適中,無(wú)雜峰干擾,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確,可靠。藤黃酸的全波長(zhǎng)掃描最大吸收波長(zhǎng)為361nm,該檢測(cè)波長(zhǎng)下分離度好,其他雜峰干擾小,能滿(mǎn)足測(cè)定要求。
對(duì)藤黃酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行穩(wěn)定性考察時(shí),因藤黃酸結(jié)構(gòu)含多個(gè)酚羥基,很容易被氧化[1],對(duì)照品放置12h后,發(fā)現(xiàn)藤黃酸不穩(wěn)定,其后出現(xiàn)了一個(gè)小峰,同時(shí)含量降低,所以在配制標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用,以免藤黃酸在空氣中暴露太久,被氧化變質(zhì)。
除回流提取方法本實(shí)驗(yàn)還考察了另外一種提取方法超聲提取方法,結(jié)果顯示回流提取法和超聲提取法含量無(wú)顯著性差異,但由于供試品中含有黏稠性基質(zhì),超聲提取無(wú)法除去黏稠成分,進(jìn)樣時(shí)易吸附在色譜柱上,沖洗柱子不方便,對(duì)色譜柱傷害較大,所以本實(shí)驗(yàn)最終選擇回流提取法。
分別考察了 5、10、20、30μL 進(jìn)樣量,發(fā)現(xiàn) 20 和30μL時(shí)由于濃度過(guò)大分離度不好,藤黃酸及其同分異構(gòu)體分不開(kāi),進(jìn)樣量10μL時(shí)峰易分開(kāi),沒(méi)有肩峰現(xiàn)象,重現(xiàn)性也良好。
本實(shí)驗(yàn)曾考察25、30℃兩種柱溫,柱溫影響并不大,但考慮到耐用性等問(wèn)題選擇用30℃為柱溫。
本研究以藤黃酸為指標(biāo),對(duì)藤黃的古方外用制劑藤黃酊與藤鋅散和現(xiàn)代醫(yī)院制劑含藤黃外用制劑與實(shí)驗(yàn)室自制制劑的質(zhì)量控制進(jìn)行研究,結(jié)果表明所建立的方法簡(jiǎn)便快速,穩(wěn)定可靠,能有效控制藤黃酸的使用量,用于該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià),以此為藤黃外用制劑的質(zhì)量控制提供了科學(xué)可靠的依據(jù)。