李欣蔚，張 勇

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110161）

人類對(duì)肉食質(zhì)量的感知是在咀嚼的過(guò)程中，肉食發(fā)生復(fù)雜物理化學(xué)變化，并刺激口腔和鼻腔內(nèi)感覺(jué)神經(jīng)末梢而產(chǎn)生的。在諸多的主觀感覺(jué)因素中嫩度是最重要的。嫩度是豬肉品質(zhì)結(jié)構(gòu)特性的反映?？陀^評(píng)定嫩度通常用肉的剪切力值來(lái)表示。

1 骨骼肌結(jié)構(gòu)與肉品品質(zhì)的關(guān)系

1.1 肌纖維直徑與肉質(zhì)

諸多研究表明，肌纖維直徑越小，肉質(zhì)越嫩；肌纖維直徑越大，肉質(zhì)越差。川井田博、曾勇慶、吳德等分別對(duì)豬的纖維直徑與肉質(zhì)之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，纖維直徑與肉品的柔嫩度密切相關(guān)，且我國(guó)地方豬種肌纖維直徑比引進(jìn)豬種的肌纖維直徑要細(xì)，相應(yīng)的肉品嫩度較好[1-3]。與此同時(shí)，肌纖維直徑與肌肉嫩度的關(guān)系已被廣大學(xué)者應(yīng)用于禽肉嫩度的研究中，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)后得到相同結(jié)論。

1.2 肌纖維密度與肉質(zhì)

有研究證明，隨著肌纖維的增粗，肌肉間結(jié)締組織與脂肪含量增加，肌纖維密度下降；骨骼肌肌纖維越細(xì)，肌束內(nèi)肌纖維越密，肉質(zhì)也越嫩。Ashmore,Suzuki和Johnsfone在所建立的動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)模式中指出，動(dòng)物出生后肌纖維數(shù)保持不變。因此，家畜出生后肌肉體積的增加主要是由于已存在肌纖維體積的增大[4-6]。近年來(lái)，諸多學(xué)者針對(duì)肌纖維密度與肉質(zhì)的關(guān)系，以豬、牛等為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)。Veiseth-Kent,E等認(rèn)為肌纖維越細(xì)，肌纖維密度大，肌肉脂肪含量高，肉質(zhì)越嫩[5]。

1.3 結(jié)締組織、脂肪組織的分布與肉質(zhì)

1.3.1 結(jié)締組織的性質(zhì)和含量

構(gòu)成結(jié)締組織的主要成分是膠原纖維蛋白，存在于肌外膜、肌束膜和肌內(nèi)膜，肌腱中更多，且在酸堿環(huán)境中可膨脹；彈性纖維蛋白存在于肌肉血管壁、韌帶等；網(wǎng)狀蛋白存在于任何組織中，含量少。大量研究證實(shí)，肉品嫩度同結(jié)締組織中的膠原纖維和彈性纖維的含量顯著相關(guān)。Aberle等（1981）發(fā)現(xiàn)，牛肉膠原蛋白的溶解性降低時(shí)，牛肉的嫩度隨之下降[7]。

此外，肌肉中的結(jié)締組織含量、結(jié)締組織中膠原蛋白的種類和交聯(lián)程度是影響肉嫩度的重要因素。膠原蛋白中最重要的交聯(lián)反應(yīng)是賴氨酸分子在賴氨酰氧化酶作用下，氧化脫氨形成醛基，與另一賴氨酸分子的氨基縮合形成醛亞胺鍵（CH=N-CH2）。這種分子鍵的交聯(lián)作用是使膠原蛋白具有必要的韌性和強(qiáng)度。隨著動(dòng)物年齡增長(zhǎng)，體內(nèi)膠原蛋白的總量并不明顯增加，但膠原蛋白的交聯(lián)更加穩(wěn)定，因而肌肉就更粗糙，嫩度更低。

1.3.2 脂肪的含量和分布

一般認(rèn)為，肌內(nèi)脂肪含量對(duì)豬肉品質(zhì)影響較大，尤其是嫩度和多汁性。Herry等（1963）報(bào)道，豬肉大理石紋與肉嫩度的相關(guān)系數(shù)r=0.62。Fernandez等（1999）研究了杜洛克×大白雜種閹公豬腰大肌肌內(nèi)脂肪對(duì)大理石紋評(píng)分及肉嫩度的影響，結(jié)果表明，隨著肌內(nèi)脂肪含量的增加，大理石紋評(píng)分也相應(yīng)的提高，且顯著（P＜0.01）[8]。肌肉中的脂肪組織大部分分布在肌束膜上，肌間脂肪對(duì)肌肉的嫩化作用有一種解釋：它分割并稀釋了結(jié)締組織纖維，使其更適合熱處理，熱加工時(shí)，脂肪細(xì)胞破裂，脂肪顯著的進(jìn)行再分布，融化的脂肪會(huì)產(chǎn)生令人滿意的口感增加肉的美味。Wood等認(rèn)為，肌肉內(nèi)脂肪是通過(guò)2方面的作用來(lái)改善肉的嫩度。一是切斷了肌纖維束間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)；二是有利于咀嚼過(guò)程中肌纖維的斷裂[9]。

1.4 肌纖維類型與肉品嫩度

肌纖維類型可直接通過(guò)肌纖維直徑或間接通過(guò)對(duì)肌內(nèi)脂肪的影響，在一定程度上影響肌肉的嫩度。就肌纖維直徑而言，I型纖維直徑較細(xì)，而2b型纖維直徑較粗。因此，在相同屠宰和儲(chǔ)藏條件下，肌肉2b型纖維比例增大，會(huì)增加肌肉的剪切力，從而降低肉品嫩度。漢普夏豬與瑞典約克夏豬相比，肉質(zhì)更嫩，就是由于約克夏豬種酵解型肌纖維所占比例較高。

2 鈣蛋白酶系統(tǒng)的研究進(jìn)展與致嫩機(jī)理

2.1 鈣蛋白酶的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性

廣泛存在的鈣蛋白酶（calpain）有2種，μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶，兩者均由不均一的二聚體蛋白構(gòu)成，其大、小亞基的分子質(zhì)量分別為80和30 ku。大亞基具有催化活性，μ-Calpain與m-Calpain的大亞基分別由CAPN1和CAPN2基因編碼；小亞基具有調(diào)節(jié)功能。盡管μ-Calpain和m-Calpain大亞基氨基酸序列有明顯差異，但是其高級(jí)結(jié)構(gòu)基本相同，都由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，從N端起分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ結(jié)構(gòu)域。在大亞基中，結(jié)構(gòu)域Ⅰ由1～80位氨基酸殘基組成，約占全部分子的10%，在蛋白酶激活的情況下很容易發(fā)生自溶，由此推測(cè)其可能起鈣蛋白酶的活性調(diào)節(jié)作用，μ-Calpain和m-Calpain僅在結(jié)構(gòu)域Ⅰ中不同；結(jié)構(gòu)域Ⅱ含有81～330位氨基酸殘基，約占全部分子的35%，是表現(xiàn)鈣蛋白酶水解活性的關(guān)鍵部位，在未被激活的條件下含有2個(gè)次級(jí)區(qū)域；結(jié)構(gòu)域Ⅲ由351～560位氨基酸殘基組成，約占全部分子的35%，其功能為結(jié)合鈣離子和磷脂，與蛋白酶調(diào)控亞基或其他調(diào)控蛋白有關(guān)；結(jié)構(gòu)域Ⅳ由561～705位氨基酸殘基組成，占全部分子的20%，是結(jié)合鈣離子的部位，含有4個(gè)鈣結(jié)合蛋白所持有的EF-手型結(jié)構(gòu)。

鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）是細(xì)胞內(nèi)專一抑制Calpain活性的蛋白質(zhì)。通過(guò)抑制Calpain的活性，可抑制肌肉內(nèi)蛋白質(zhì)降解，參與肌肉生長(zhǎng)過(guò)程中蛋白質(zhì)的更新。Calpastatin蛋白共由5個(gè)部分（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）組成，其中4個(gè)是Calpastatin蛋白的活性中心。當(dāng)Calpain被鈣離子激活后，如果附近有Calpastatin存在，則將迅速與之結(jié)合而抑制Calpain活性，從而保證Calpain對(duì)底物只進(jìn)行局部的特定位點(diǎn)的水解。

2.2 鈣蛋白酶致嫩機(jī)理

μ-Calpain和m-Calpain都能水解肌原纖維。其可能機(jī)制是，鈣蛋白酶被激活后，首先攻擊肌原纖維的肌節(jié)（2個(gè)相鄰Z盤之間的一段肌原纖維）的部位，釋放肌絲使降解為小片段，然后被溶酶體所捕獲而進(jìn)一步降解。由于連接蛋白和半肌動(dòng)蛋白分別以N、C末端和Z盤結(jié)合，其多肽鏈分別從I帶延伸到A帶，起著使粗絲、細(xì)絲和Z盤牢固結(jié)合的作用。但近期研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶首先水解的是N2線，據(jù)報(bào)道N2線是連接蛋白和半肌動(dòng)蛋白所在區(qū)域，它們分別連接粗肌絲和細(xì)肌絲，最終通過(guò)I帶伸向Z盤。在降解N2線的同時(shí)也會(huì)降解一些骨架蛋白，使肌纖維釋放肌絲。細(xì)肌絲的肌原蛋白和原肌球蛋白及粗肌絲的C-蛋白降解，分別解離出肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白。釋放出的粗肌絲和細(xì)肌絲可與母體或其他肌原纖維重新裝配，也可以被胞質(zhì)蛋白酶或溶酶體降解，導(dǎo)致肌原纖維的有序結(jié)構(gòu)被破壞，從而有利于肉的嫩化。但在宰后成熟的過(guò)程中m-Calpain的活性幾乎不變，而μ-Calpain的活性則顯著下降。因此，人們普遍接受μ-Calpain而不是m-Calpain參與了肉的嫩化。并且μ-Calpain的自溶和失活是分子間過(guò)程，即使自溶程度很大，它也能完全失活；m-Calpain的自溶是分子內(nèi)過(guò)程，自溶會(huì)導(dǎo)致m-Calpain不完全失活。所以，μ-Calpain是蛋白質(zhì)降解過(guò)程中引起肉嫩化的主要酶。

鈣蛋白酶抑制蛋白是通過(guò)抑制鈣蛋白酶的自溶作用而發(fā)揮作用的，且這種抑制作用并不受pH的影響。Koohmaraie指出，可用牛肉宰后24 h鈣蛋白酶抑制蛋白的濃度來(lái)預(yù)測(cè)最終嫩度。Senky指出豬肉宰后1 h的鈣蛋白抑制蛋白濃度與成熟肉的嫩度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.263,即可用鈣蛋白酶水平預(yù)測(cè)60%的嫩度水平。

3 影響嫩度的候選基因的研究進(jìn)展

3.1 MyoD基因家族

哺乳動(dòng)物肌纖維在胚胎形成過(guò)程中受到MyoD家族的調(diào)控。MyoD家族包括MyoDⅠ、MYOD（myogenin,肌細(xì)胞生成素）、myf-5和myf-6。它們編碼堿性螺旋—環(huán)—螺旋蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)肌肉分化階段特異性蛋白的表達(dá)來(lái)參與肌細(xì)胞的分化。其中myf-5和MyoDⅠ在肌細(xì)胞增殖過(guò)程中表達(dá)；MyoDⅠ在肌細(xì)胞分化末期表達(dá)；而myf-6主要在生后表達(dá)。Soumillion等利用4種人MyoD cDNA混合片段掃描豬基因組確定了MYOG基因，并發(fā)現(xiàn)了3個(gè)MspⅠ多態(tài)性位點(diǎn)[10]。MYOG可能與出生重、生長(zhǎng)速度、胴體瘦肉率有關(guān)。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，p204蛋白對(duì)成肌纖維分化是必須的，是通過(guò)解除Id蛋白（DNA結(jié)合抑制劑）對(duì)MyoD和E47蛋白活動(dòng)的抑制而實(shí)現(xiàn)的[11]。

3.2 宰后肌肉蛋白水解因子——組織蛋白酶B

作為一類重要的蛋白酶，組織蛋白酶在生物體內(nèi)最重要的生理功能就是水解特定的蛋白質(zhì)，在活體內(nèi)主要承擔(dān)水解胞內(nèi)代謝廢物以及異物的功能。Calkins等報(bào)道，組織蛋白酶B在牛肉成熟的1～14 d和3～6 d內(nèi)，對(duì)剪切力降低的貢獻(xiàn)率分別為35%和58%。另外，組織蛋白酶能將肌肉中的某些蛋白質(zhì)成分分解成質(zhì)量不等的肽類和游離氨基酸，進(jìn)而降解成醛類和酮類化合物，這些成分均是食品肉類、干腌火腿中的風(fēng)味成分。Russo等提出應(yīng)該將組織蛋白酶B作為影響豬肉嫩度性狀的候選基因加以研究。

組織蛋白酶B具有限制底物進(jìn)入它們的活性中心的特征。其成熟蛋白結(jié)構(gòu)中有一18個(gè)氨基酸長(zhǎng)的閉塞環(huán)，阻止底物進(jìn)入位于主要結(jié)合區(qū)的活性位點(diǎn)，并且提供2個(gè)組氨酸His119和His111來(lái)結(jié)合底物C-末端的帶有陰性電荷的羧基團(tuán)，這可以部分解釋組織蛋白酶B比該家族其他成員具有相對(duì)較弱的內(nèi)肽酶活性和其獨(dú)特的羧肽酶活性。

3.3 肌內(nèi)脂肪的候選基因

3.3.1 心臟脂肪酸結(jié)合蛋白基因

心臟脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）主要在心肌和骨骼肌中表達(dá)。Gerbens等用豬/鼠細(xì)胞雜交克隆板的方法將H-FABP定位于6號(hào)染色體；他們對(duì)純種杜洛克豬的研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)與肌內(nèi)脂肪有顯著相關(guān)的H-FABP多態(tài)性位點(diǎn)。他們的研究還表明，肌內(nèi)脂肪與H-FABP存在顯著相關(guān)。國(guó)內(nèi)的林萬(wàn)華等對(duì)中外10個(gè)豬種H-FABP遺傳變異進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)6個(gè)地方豬種均表現(xiàn)為dd型，而外國(guó)豬種和培育豬種南昌豬則表現(xiàn)出多態(tài)性，這些多態(tài)性是否可作為遺傳標(biāo)記還有待于進(jìn)一步研究。這些研究結(jié)果提示H-FABP極有可能是肌內(nèi)脂肪的候選基因。

3.3.2 脂肪組織脂肪酸結(jié)合蛋白基因

Gerbens等分離了脂肪組織脂肪酸結(jié)合蛋白（A-FABP）基因，并進(jìn)行了測(cè)序。A-FABP在人、小鼠和大鼠之間高度保守，尤其是所有功能部位的氨基酸序列都是高度保守的。A-FABP被定位于豬4號(hào)染色體。Gerbens等對(duì)純種杜洛克豬的研究表明，A-FABP多態(tài)性與IMF間存在顯著相關(guān)。Gerbens等在10個(gè)基因型豬群中檢測(cè)到6個(gè)微衛(wèi)星等位基因，其中A6A9較其他基因型的肌內(nèi)脂肪含量較高。巧合的是這2個(gè)A6A9基因型個(gè)體與其MspI PCRRFLP的aa基因型表現(xiàn)相同。他們還研究了H-FABP、A-FABP mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)系。結(jié)果表明，A-FABP mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪之間沒(méi)有顯著相關(guān)。H-FABP mRNA表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量之間沒(méi)有顯著相關(guān)。H-FABP mRNA表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量差異有關(guān)，但在蛋白質(zhì)表達(dá)水平上各基因型間沒(méi)有顯著差異?？傊€不能從其表達(dá)水平上解釋2種FABP與肌內(nèi)脂肪遺傳變異之間的關(guān)系。但他們?nèi)匀徽J(rèn)為FABP mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量有關(guān)。

3.4 鈣蛋白酶家族基因

根據(jù)鈣蛋白酶表現(xiàn)半最高活性所需的Ca2+濃度的不同，可以將普遍存在的鈣蛋白酶分為2種：一種為μ-calpain (又稱calpain I)，激活所需Ca2+濃度為微摩爾級(jí)；另一種為m-calpain (又稱calpain II)，激活所需Ca2+濃度為毫摩爾級(jí)。已經(jīng)鑒定了μ-calpain-1兩種同工型cDNA的核苷酸序列。豬CAPN1A cDNA開(kāi)放讀碼框架約2142 bp，與人和牛的分別有92%和94%的同源性；CAPN1B cDNA開(kāi)放讀碼框架約1941 bp，它與CAPN1A cDNA前1941個(gè)堿基完全相同。用2點(diǎn)連鎖分析法，μ-calpain基因被定位于2號(hào)染色體上。

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