朱仁俊，石振興，甘伯中，胡永金

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，昆明 650201；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

凝乳酶的研究進展

朱仁俊1，石振興1，甘伯中2，胡永金1

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，昆明 650201；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

介紹了凝乳酶的來源結(jié)構(gòu)、理化特性及凝乳機理，對提高微生物源凝乳酶的活力、產(chǎn)量的研究進展及未來凝乳酶研究領(lǐng)域的開發(fā)進行了綜述，并對其應(yīng)用前景和開發(fā)進行展望。

凝乳酶；干酪；凝乳活力；蛋白分解力

0 引 言

凝乳酶是干酪生產(chǎn)中使乳液凝固的關(guān)鍵性酶。它對干酪的質(zhì)構(gòu)形成及特有風(fēng)味的形成有非常重要的作用[1]。目前國際市場上凝乳酶中動物來源的約占70%，微生物的占30%，植物的不到1%，雖然動物凝乳酶凝活力與蛋白水解能力的比值高，但是動物生長緩慢且價格昂貴；植物凝乳酶蛋白水解能力強，其生產(chǎn)也受時間、地域等條件制約，利用微生物生產(chǎn)凝乳酶成本低，生產(chǎn)能力可以不受限制地擴大，國外一些公司早已利用改良菌種生產(chǎn)出高活力的凝乳酶，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟效益。我國自80年代末開展了凝乳酶的研究，但目前，國內(nèi)大部分凝乳酶仍依賴于進口。當(dāng)前優(yōu)先發(fā)展的高科技產(chǎn)業(yè)化重點領(lǐng)域中，凝乳酶被列為我國重點開發(fā)的酶制劑之一[3]。

1 凝乳酶的來源

1.1 動物源凝乳酶

動物性凝乳酶主要是胃蛋白酶。直到20世紀(jì)末，人們一直使用小牛的皺胃進行凝乳酶的加工，但以宰殺小牛獲得凝乳酶無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，而且成本較高，為此，人們開發(fā)了多種皺胃酶的替代品。除可在小牛胃中提取凝乳酶外，豬、羊、狗的胃中也可以提取凝乳酶[4]。張富新等[5]研究了不同因素對羔羊皺胃酶凝乳活性的影響。但羔羊皺胃酶凝乳性較低，影響了它的使用價值。劉文宗等[6]實驗研究證明用乳豬胃酶替代小牛皺胃酶是可行的，且效果不錯。水生動物中也能提取凝乳酶制劑,如鱉魚能以酶原的形式分泌酸性蛋白酶，其胃粘液中的蛋白酶具有凝乳活性[7]。Haard[8]從海豹的胃和胃粘液中提取一種蛋白酶，這種酶在pH值為6.0～6.8范圍內(nèi)有很好的凝乳活性，制造出的Cheddar干酪風(fēng)味正常，是一種很有潛力的皺胃酶替代品。Tavares等人[9]報道：從金槍魚胃黏膜中提取出來的粗胃蛋白酶可作為凝乳酶的代用品，該酶來源廣泛，因此價格低廉，是一種較好的凝乳酶代用品。盡管如此，但由于動物資源不如植物和微生物豐富，各國學(xué)者紛紛將研究目標(biāo)轉(zhuǎn)向植物和微生物源凝乳酶。

1.2 植物源凝乳酶酶

許多植物來源的蛋白酶具有凝乳的性質(zhì)，植物凝乳酶來源廣泛，己知木瓜、無花果、菠蘿、南瓜、合歡樹、銀杏等植物中都含有能使乳凝固的蛋白酶。其中對無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、波蘿酶研究最為廣泛。張富新等人[10]對無花果蛋白酶的凝乳特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其有較好的凝乳性。但許多研究表明植物性凝乳酶蛋白水解活力高，在加工干酪時影響其風(fēng)味和產(chǎn)量，并且受時間、地域、生長周期長等條件限制，難以發(fā)展[11]。

1.3 微生物源凝乳酶

微生物凝乳酶是目前最有前途的發(fā)展方向。微生物生長周期短，產(chǎn)量大，受氣候、地域、時間限制小，用其生產(chǎn)凝乳酶成本較低、酶提取方便、經(jīng)濟效益高[11]。微生物凝乳酶可以劃分為霉菌、細(xì)菌、擔(dān)子菌3種來源的制劑。生產(chǎn)中應(yīng)用最多的是來源于霉菌的凝乳酶，其代表物是從微小霉菌（mucorpusillus）中分離出來的凝乳酶，分子質(zhì)量為29800 u，凝乳的最適溫度為56℃，蛋白分解力比皺胃酶強，但較其他蛋白酶的蛋白分解能力弱，對牛乳的凝固作用較強[3]。郭光遠(yuǎn)等[12]人從2127株放線菌篩選的初步結(jié)果表明，62%的高溫鏈霉菌菌株產(chǎn)生凝乳酶，產(chǎn)酶活力較高（100U／mL）的菌株占5.2%：中溫鏈霉菌有11.3%的菌株產(chǎn)酶，活性較高的占2.2%。小單孢菌、諾卡氏菌、馬拉杜放線菌、高溫放線菌也都有產(chǎn)凝乳酶的活力。對215株真菌的篩選結(jié)果表明，有9.8%的菌株產(chǎn)生凝乳酶。細(xì)菌有8.8%的菌株產(chǎn)凝乳酶，活性較高的占3.1%[11]。孫健等[13]從17株產(chǎn)凝乳酶的霉菌中初篩到產(chǎn)酶最較高的總狀毛霉（Mucor racemosus）菌株。劉振民等[14]發(fā)現(xiàn)酒藥中的主要菌系-根霉，具有一定的產(chǎn)凝乳酶活力，可作為凝乳酶的潛在生產(chǎn)菌。目前微生物凝乳酶應(yīng)用最多的是微小毛霉（Mucor pusillus）產(chǎn)生的凝乳酶。微小毛霉凝乳酶的蛋白分解力比皺胃強，但比其它的蛋白酶蛋白分解力弱，對牛乳凝固力強。錢世均等[15]人從19株毛霉中篩選出一株微小毛霉菌株，并對其產(chǎn)生的凝乳酶進行了純化和酶學(xué)性質(zhì)的研究。

2 凝乳酶結(jié)構(gòu)、理化特性及凝乳機理

2.1 凝乳酶的結(jié)構(gòu)及理化特性

凝乳酶原分子量為40，777u（365個氨基酸），在酸性條件下N末端的42個氨基酸能夠自我剪切掉，形成分子量為35，622 Da（323個氨基酸）有活性的成熟凝乳酶。凝乳酶蛋白為腎形，大小為49?×50?×65?。它具有酸性蛋白酶家族的類二折疊對稱的結(jié)構(gòu)特點，與其他真核細(xì)胞天冬氨酸蛋白酶有高度的同源性，變異范圍在30%～60%之間。通過X線衍射研究發(fā)現(xiàn)：凝乳酶分子可分為由1～175氨基酸殘基組成的N端區(qū)域和由176～323氨基酸殘基組成的C端區(qū)域，兩個區(qū)域之間是一個深溝狀的活性部位[16]。凝乳酶以β片層結(jié)構(gòu)為主，每個區(qū)域的β結(jié)構(gòu)都由正向平行和反向平行的β折疊組成。每個部分都有一些α螺旋的短片段與β折疊相連，通常一個區(qū)域內(nèi)的β折疊在另一個區(qū)域有局部相同的片段，而α螺旋則沒有。在N端區(qū)域和C端區(qū)域的分離裂溝底部發(fā)現(xiàn)兩個天冬氨基酸活性位點：Asp-34和Asp-216。氨基酸殘基和水分子在活性位點形成廣泛的氫鍵網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以維持凝乳酶的類二折疊對稱結(jié)構(gòu)。二硫鍵Cys-250和Cys一283對于酶的活性有重要意義，如果將這兩個二硫鍵羧基化或汞化，可使酶活性降低25%。凝乳酶等電點為pH值為4.5。干燥物活性穩(wěn)定，但水溶液不穩(wěn)定，水溶液的pH值約為5.8，對牛奶凝固的最適pH值為5.8，最適溫度為37-43℃，在15℃以下和55℃以上時不呈活性。幾乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚。凝乳酶以兩個等位基因A和B的其中一種形式表達(dá)，A的244位點為Asp，而B為Gly，凝乳酶A和B活性的不同歸因于Asp244的強電子活性導(dǎo)致的鍵親和力增加[17]。凝乳酶A對K-酪蛋白有更強的活性，但比凝乳酶B缺少穩(wěn)定性。凝乳酶C是凝乳酶A的自溶產(chǎn)物，由凝乳酶A自行切除Asp286-Glu287-Phe288而產(chǎn)生C[18]。

2.2 凝乳酶的凝乳機理

凝乳酶凝乳過程可分為兩步：第一步是酶專一性地水解乳中酪蛋白多肽鏈的105～106位苯丙氨酸和甲硫氨酸之間的肽鍵，形成穩(wěn)定的副酪蛋白及親水性的糖巨肽；第二步是當(dāng)總的酪蛋白被水解掉約85%時，在鈣離子存在下通過在酪蛋白膠粒間形成的化學(xué)鍵形成凝塊或凝固的乳[19]。這是由于酪蛋白的穩(wěn)定性在于κ-酪蛋白分子層的存在，κ-酪蛋白分子位于酪蛋白膠束表面，亞基之間以疏水鍵和膠體磷酸鈣相互作用的方式連接在一起。酪蛋白在凝乳酶的作用下，酪蛋白膠粒表面κ-酪蛋白分子層部分分解，膠粒內(nèi)部的αs、β-酪蛋白失去膠體保護作用，變?yōu)楦崩业鞍?，而副酪蛋白在鈣離子存在下，形成不溶性凝塊。理想的凝乳酶應(yīng)能迅速、專一地打開κ-酪蛋白的Phe105-Met106鍵，而水解其他肽鍵的蛋白水解能力低，即兩者的活力比值要高[11]。

3 提高微生物源凝乳酶的活力及產(chǎn)量的研究進展

3.1 優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

在培養(yǎng)產(chǎn)凝乳酶微生物的過程中，主要研究集中在挑選凝乳活力較高而蛋白水解活力相對較低的產(chǎn)酶菌株。甘伯中等[20]對微生物凝乳酶固態(tài)發(fā)酵條件的研究中發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)基固液比為1︰0.8，產(chǎn)酶最適培養(yǎng)基為：麩皮10 g，水8 g，硝酸銨1 g氯化鈣0.08 g；最佳產(chǎn)酶條件為28℃，接種量為10%，培養(yǎng)72 h，起始pH值為6.5，并得出微小毛霉誘變菌株HL-1可高效產(chǎn)凝乳酶[19]。周俊清[19]在凝乳酶優(yōu)良菌株的選誘及其酶活特性的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘變后的菌株UH-19液體搖瓶發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方：鼓皮9%，乳清粉1%，CaCl2為0.2%，NaH2PO4為0.43%，無水NaCO3為0.1%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳條件：種子菌齡為48 h，溫度為30℃，發(fā)酵48 h，培養(yǎng)液起始的pH值為7.0，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。孫健等[13]對變異后的總狀毛霉R132進行了產(chǎn)酶最優(yōu)條件的探討，發(fā)現(xiàn)R132株適于液體培養(yǎng)產(chǎn)生凝乳酶；對培養(yǎng)基有機成分進行了L9（34）的正交試驗，結(jié)果證明葡萄糖為顯著因子，麩皮次之，奶粉與豆粉顯示較弱的負(fù)效應(yīng)。選出了優(yōu)化的培養(yǎng)基配方：麩皮4%， 葡萄糖6%，NaNO30.3%，KH2PO40.05%，Mg-SO40.025%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；在此培養(yǎng)條件下，酶活性比值有較大提高。郭光遠(yuǎn)等[12]研究了菌株Y85一8512的發(fā)酵條件與產(chǎn)酶關(guān)系，認(rèn)為液體種子10%的接種量發(fā)酵72 h酶活力最高。劉振民等[14]在對酒藥中凝乳酶菌株篩選及產(chǎn)酶條件的研究中得出：土豆汁培養(yǎng)基有利于酶的產(chǎn)生，酶活可達(dá)11.08U/mL。

3.2 誘變育種

大多數(shù)野生菌株產(chǎn)凝乳酶活力較低，產(chǎn)生的酶蛋白水解力也比較高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。因此可通過對菌株有目的地進行人工誘變，提高突變頻率，迅速獲得優(yōu)良高產(chǎn)的菌種，從而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益[11]。在對產(chǎn)凝乳酶菌株的誘變育種方面，有不少學(xué)者做了大量的研究，以獲得產(chǎn)凝乳酶活力高和蛋白水解力低的菌株。郭光遠(yuǎn)等[12]對56株酶活力超過l00 u/ml的菌株進行反復(fù)對比后，選定一株毛霉（Mucor sp.）代號Y85-8512和一株芽抱桿菌（Bacillus sp.）代號Y85-8501作出發(fā)菌，經(jīng)誘變選育得到酶活比值高且凝乳活力分別可達(dá)到5000 U/g和l0000 U/g的穩(wěn)定高產(chǎn)菌株。周俊清等[19]在凝乳酶優(yōu)良菌株的選誘及其酶活特性的研究中以細(xì)菌BZ-17為出發(fā)菌株，通過誘變篩選出一株變異菌株UH-9，該菌株所產(chǎn)酶與出發(fā)菌株相比，凝乳活力提高279.32%，蛋白水解活力降低了80.88%，并經(jīng)過5代遺傳穩(wěn)定性試驗表明該菌株所產(chǎn)酶的活力可保持在穩(wěn)定的水平。矯慶華等[21]人研究認(rèn)為，微小毛霉602在含有50%～60%麩皮的半固體培養(yǎng)基中，起始pH值為5.0～6.7，28℃條件下培養(yǎng)96 h，所產(chǎn)生的酶具有較高凝乳活性和較低的蛋白水解力，補加葡萄糖、蔗糖、硫酸餒、乳清粉均對產(chǎn)酶無顯著的影響。利用誘變育種，可獲得產(chǎn)高效凝乳酶的菌株，但此法隨機性和盲目性較大，工作也較繁鎖，結(jié)果難以預(yù)測，若結(jié)合現(xiàn)代統(tǒng)計分析軟件和技術(shù)，合理設(shè)計實驗，將會大量減少工作量，取得較理想的結(jié)果。

3.3 基因工程育種

基因工程育種是把某一生物體的遺傳物質(zhì)在體外經(jīng)限制性內(nèi)切酶與連接酶剪接，與一定載體（質(zhì)粒、病毒等）相連接，構(gòu)成重組DNA分子，通過一定的方法轉(zhuǎn)入另一生物體（受體）細(xì)胞中，使被導(dǎo)入的外源DNA片段在受體中表達(dá)，并穩(wěn)定遺傳[19]。基因工程育種是當(dāng)今最重要也是人們研究最多的高新生物技術(shù)之一，與誘變育種技術(shù)相比，它是人們在生物學(xué)指導(dǎo)下可預(yù)先設(shè)計和控制的育種新技術(shù)使試驗向預(yù)定的方向進行，減少了傳統(tǒng)育種的隨機性和盲目性[22]。克氏乳酸菌具有良好的發(fā)酵屬性，Madzak等[23]用XPR2啟動子調(diào)控前凝乳酶基因的表達(dá)，其活性凝乳酶的產(chǎn)量明顯高于由Y脂肪分解酶啟動子調(diào)控的凝乳酶表達(dá)的產(chǎn)量。霉菌中比較適合轉(zhuǎn)入凝乳酶基因的霉菌是米黑氏毛霉菌，不斯理毛霉菌，寄生毛霉菌和黑曲霉。Tsuchiya等[24]發(fā)現(xiàn)用米曲霉作為牛凝乳酶源表達(dá)載體具有高效表達(dá)異源性蛋白質(zhì)的特點。Tsuchiya構(gòu)建了PEG31、PFG33兩種質(zhì)粒：以Cla-A作啟動子的PFG31質(zhì)粒帶有Gla-A-1-633Aaa基因， 缺C端9個Aa基因PFG33質(zhì)粒帶Gla-A-1-511Aa基因，缺糖結(jié)合位點，從這兩種質(zhì)粒在米曲霉中表達(dá)情況的研究中發(fā)現(xiàn)F316菌株 （含PFG33質(zhì)粒）產(chǎn)凝乳酶原量最高。Cardoza和Gutierrez構(gòu)建了兩種重組質(zhì)粒，一種將3-磷酸甘油醛脫氫酶（gpdA）調(diào)控基因與前凝乳酶源基因構(gòu)建在一起，另一種將曲霉菌胃蛋白酶B（pepB）調(diào)控基因與凝乳酶源基因構(gòu)建在一起，將它們分別轉(zhuǎn)化黑曲霉菌（A.awamori）,發(fā)現(xiàn)黑曲霉的兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子都能分泌牛凝乳酶，而且無論是酶的活性還是抗原性都是一致的[25]。

用大腸桿菌生產(chǎn)重組凝乳酶，通過質(zhì)粒構(gòu)建、加強質(zhì)粒穩(wěn)定性、選擇合適菌株、改善培養(yǎng)基成分和生長溫度等來提高產(chǎn)量.已經(jīng)取得了很多進展。Mohanty等[17]分別將Lac調(diào)控基因和Trp-beta調(diào)控基因與前凝乳酶基因構(gòu)建在一起，使凝乳酶能在大腸桿菌中表達(dá)，但重組蛋白以細(xì)胞內(nèi)包含體形式存在，需在下游操作中進行變形、復(fù)性的處理。王志林等[26]通過設(shè)計一對特異性引物，采用RT-PCR技術(shù)從未成熟的木瓜組織中擴增得到木瓜凝乳酶基因，并將其重組到pPIC9K載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并篩選陽性克隆，得到的基因為木瓜凝乳酶基因。

3.4 蛋白質(zhì)工程育種

蛋白質(zhì)工程這一技術(shù)是編碼蛋白質(zhì)的基因DNA堿基排列順序或蛋白質(zhì)的氨基酸序列順序或蛋白質(zhì)的氨基酸序列完全清楚的基礎(chǔ)上進行的。天然的凝乳酶由于具有凝乳活力低，蛋白水解能力強等一些缺陷，在生產(chǎn)實踐上的應(yīng)用受到很大制約。因此，利用蛋白質(zhì)工程對凝乳酶進行定向的分子改造，研究凝乳酶分子中特定氨基酸殘基與其功能之間的關(guān)系，通過基因定點突變技術(shù)可以實現(xiàn)酶分子中特定氨基酸殘基的替換，通過替換前后兩種酶蛋白質(zhì)的比較就可以進一步闡明凝乳酶分子結(jié)構(gòu)與其特定性質(zhì)之間的確切關(guān)系，繼而改善其相應(yīng)的酶學(xué)性質(zhì)。目前對凝乳酶結(jié)構(gòu)方面的研究主要是復(fù)性過程中二硫鍵的重折疊問題。牛凝乳酶在復(fù)性過程中由于二硫鍵的正確折疊率、配對率較低，導(dǎo)致凝乳酶的表達(dá)率低。因此，設(shè)想通過蛋白質(zhì)工程將牛凝乳酶的二硫鍵減少，以期提高復(fù)性率。Huang K等人[27]發(fā)現(xiàn)凝乳酶中Cys250-Cys283鍵是決定必需的，Cys45-Cys50是可取代的[28]，而Cys206-Cys210對凝乳酶的正確折疊不是必需的[29]。

弄清每對二硫鍵的功能與性質(zhì)后，就可以利用蛋白質(zhì)工程對凝乳酶在不改變其原有性質(zhì)的基礎(chǔ)上提高復(fù)性率，增加表達(dá)產(chǎn)量。同理，研究清楚凝乳酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成及一些酶學(xué)性質(zhì)后，可對其進行結(jié)構(gòu)改造，提高凝乳活力，降低蛋白水解力。然而這些工作還處于起步階段,還有很多工作要做。隨著研究工作的深入，相信高效的凝乳酶將有一個良好的發(fā)展前景[30]。

4 開發(fā)與展望

隨著我國畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，奶酪以其豐富的營養(yǎng)成分，并作為牛奶一種長期有效的保存方法，值得大力推廣。雖然人們己經(jīng)嘗試了使用各種方法，提高凝乳酶活力，降低蛋白水解力并且取得了很大進步，但是仍有很多問題沒有解決，尚需科學(xué)工作者付出艱辛的努力，不斷探索、發(fā)現(xiàn)更好的方法和找到更好的途徑獲得高效的凝乳酶[11]。可以通過篩選出更多優(yōu)良菌種，用該菌株生產(chǎn)的凝乳酶應(yīng)有效凝乳而水解活力不大,并且用其制作的奶酪質(zhì)地和風(fēng)味易被消費者接受；積極利用現(xiàn)代生物技術(shù)對產(chǎn)酶菌種進行改良，開發(fā)新型酶，以及酶的反應(yīng)技術(shù)，酶的應(yīng)用等，使之更有利于食品工業(yè)的發(fā)展。對影響凝乳酶原表達(dá)的因素開展進一步的研究，以求發(fā)現(xiàn)更多更好的載體、宿主細(xì)胞，進而不斷提高其表達(dá)率；利用固定化酶技術(shù)不失為解決凝乳酶短缺的有效途徑。

為了使我國奶酪生產(chǎn)能順利發(fā)展，解決凝乳酶的供應(yīng)矛盾，對凝乳酶的研究及開發(fā)已成為乳品業(yè)當(dāng)務(wù)之急，這方面的研究必然成為今后奶酪工業(yè)化生產(chǎn)中一個研究的熱點和難點，而且也將給社會帶來巨大的經(jīng)濟效益。

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Rearch advancement of Chymosin

ZHU Re-jun1,SHI Zheng-xing1,GAN Bo-zhong2,HU Yong-jin1
（1.Yunnan Agricultural University，College of Food Science and Technology,Kunming 650201,China；2.Gansu Agricultural University，College of Food Science and Technology,Lanzhou 730070，China）

This article describes the resource,structural composition,general characteristics,and mechanism of chymosin and overview research progression about research and prospect of chymosin in future and how to enhance clotting milk activity and production of the microbial source chymosin.Furthermore,the prospect of chymosin application was also predicted.

Chymosin;cheese;clotting milk activity;protein decomposition power

TS252.1

B

1001-2230（2010）01-0039-04

2009-08-24

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專項 （GNSW-2006-14），甘肅省科技重大專項 （0702NKDA034）。

朱仁?。?968-），男，副教授，主要從事食品科學(xué)與工程的研究。

胡永金