段翠翠，霍貴成，任大喜，馮芳菲

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

從WPC中分離β-lactoglobulin的方法

段翠翠，霍貴成，任大喜，馮芳菲

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

β-Lactoglobulin是乳清中的主要蛋白，已經(jīng)有很多方法應(yīng)用于分離提取β-Lg，但是這些方法或技術(shù)大多數(shù)比較貴或有時(shí)候比較復(fù)雜，不能夠達(dá)到足夠的產(chǎn)量或純度。介紹一種簡(jiǎn)便易行，重復(fù)性強(qiáng)，低成本的方法從濃縮乳清蛋白（WPC）中分離β-Lg，并且利用BCA法測(cè)定蛋白的質(zhì)量濃度表明提取β-Lg的質(zhì)量濃度很高，而SDS-PAGE表明提取的β-Lg有較高的純度。

蛋白純化；β-lactoglobulin；BCA；SDS-PAGE

0 引 言

乳清蛋白中的主要蛋白β-Lg是特征最明顯的牛乳蛋白之一。其在乳清中的質(zhì)量濃度約為3.2～3.4 g/L。人們基于不同的目的來(lái)分離β-Lg，因?yàn)槠渚哂袃?yōu)良的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能性質(zhì)。如果能控制分離成本，天然β-Lg有望成為非常實(shí)用的食品添加劑[1]。

已經(jīng)有很多技術(shù)被用于分離和/或提純牛乳中的各種蛋白，例如，鹽析[2，3]，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的三氯乙酸（TCA）條件下選擇性提取β-Lg[4]，陽(yáng)離子交換色譜[5-6]，高效液相色譜（HPLC）[7，8]，快速蛋白液相色譜（FPLC）以及其他的色譜技術(shù)[9,10]和等電點(diǎn)聚焦[11]。但是這些方法大多數(shù)比較貴或比較復(fù)雜。此研究的目的是開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便，易行，低成本的方式從WPC（濃縮乳清蛋白，80%）中分離β-Lg（分子量為18.3 ku）。本研究是參考文獻(xiàn)[12]中的方法，然后進(jìn)行了改進(jìn)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 蛋白分離純化系統(tǒng)

AKTA，美國(guó)UVP凝膠成像系統(tǒng)（UPLAND），CA91786 USA，酶標(biāo)儀（型號(hào)680），SDS，蛋白質(zhì)標(biāo)樣，Bio-RAd電泳儀（型號(hào)PowerPac Basic），進(jìn)口濃縮乳清蛋白粉（WPC，質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型），碧云天；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，PBS溶液，標(biāo)樣為抑肽酶，鏈霉素，β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 電泳所用試劑

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%丙烯酰胺（Acr），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%SDS（十二烷基磺酸鈉），濃度為1.5 mol/L的Trisbase緩沖液，pH值為8.8濃度為0.5 mol/L的Tris–base緩沖液，pH值為6.8質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%過(guò)硫酸銨，TEMED（四甲基乙二胺）。樣品緩沖液：去離子水15 mL，濃度為0.5 mol/L的Tris-HCl，pH值為6.8，25 mL，50%的甘油，20 mL，質(zhì)量濃度為100 g/L的SDS 40 mL；質(zhì)量濃度為1 g/L的溴酚藍(lán)、電泳緩沖液為3.03g的Tris，14.41 g甘氨酸，1 g的SDS，加水溶解至1L；染色液為0.5 g考馬斯亮藍(lán)G-250，250 ml甲醇，34 ml的冰醋酸，加水至500 mL；脫色液為75 mL冰醋酸，50 mL的甲醇，加水至1L；封存液：異丁醇；配置溶液用的水都為去離子水。

2 方 法

2.1 β-Lg的分離提取

2.1.1 酪蛋白和乳清蛋白的分離

首先用濃度為1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%）的WPC溶液，使其達(dá)到酪蛋白的等電點(diǎn)，pH值為4.6，在此pH值條件下酪蛋白和乳清蛋白分離[13]，然后以5 000 r/min轉(zhuǎn)離心20 min，收集上清液，其主要是乳清蛋白。這一步主要是去除WPC中混有的酪蛋白組分，為使去除效果較好，將上清液再離心，取上清，重復(fù)操作3次。

2.1.2 α-La和β-Lg的分離

將第一步獲得的上清液用濃度為1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.5，根據(jù)Mailliart&Ribadeau-Dumas[14]，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的NaCl濃度為6 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至2，使β-Lg，α-La和BSA分離。 用轉(zhuǎn)速為8 000 r/min離心20 min后，在上清液中回收β-Lg，沉淀中包含濃縮的組分α-La和BSA。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的NaU（pH值為2）的溶液沖洗沉淀去除沉淀中的大多數(shù)β-Lg，然后再離心，重復(fù)操作3次。隨著在上清液中不斷增加NaU的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，β-Lg被鹽析出來(lái)。在pH值為2，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的時(shí)候，出現(xiàn)β-Lg沉淀，然后用8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，將上清液倒掉，沉淀中主要是β-Lg。調(diào)節(jié)pH值為7將兩種沉淀物溶解在最少量的水中，透析，然后凍干。

2.2 蛋白分離純化進(jìn)一步提純

將凍干后的樣品溶解在少量水中，進(jìn)行蛋白分離純化，分離純化所使用的柱子是Superdex_75_10/300_GL，將樣品峰和標(biāo)樣峰做對(duì)比，選擇樣品峰中和標(biāo)樣峰中的β-Lg出峰時(shí)間或者出峰體積一致的峰，收集此峰，即是純化后的β-Lg。將收集好的β-Lg凍干濃縮體積。

2.3 脫鹽

經(jīng)過(guò)上述分離純化，然后凍干后的β-Lg中，因?yàn)橄疵撘菏菨舛葹?.05 mol/L的乙酸鈉和濃度為0.1 mol/L的氯化鈉，其中含有大量的鹽類(lèi)，所以對(duì)其脫鹽這一步驟是必不可少的，根據(jù)洗脫順序，首先流出來(lái)的是β-Lg，然后是電導(dǎo)峰，收集電導(dǎo)峰出來(lái)之前的β-Lg。將收集后的β-Lg再凍干。得到的即是比較純的β-Lg。

2.4 BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度

將分離純化后的樣品使用BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）測(cè)定所得β-Lg的質(zhì)量濃度。將20 μL質(zhì)量濃度為1 g/L的粗β-Lg加入96孔板中，設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，然后每孔加入200 μL工作試劑，于60℃溫育30 min，于酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處讀取吸光值。用試劑盒中的BCA蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，BCA法標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的具體操作是：將標(biāo)準(zhǔn)蛋白配制成質(zhì)量濃度為0.5 g/L的溶液，然后按體積為0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20μL，質(zhì)量濃度分別為0，0.025，0.5，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定，根據(jù)統(tǒng)計(jì)測(cè)定結(jié)果得到線性回歸方程為y=0.7821x+0.0838，相關(guān)系數(shù)R2=0.9957（見(jiàn)圖1）。

圖1 BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 SDS-PAGE分析蛋白的純度

（1）制備分離膠和濃縮膠：分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。

（2）樣品制備：將樣品配置成一定質(zhì)量濃度的溶液（2 g/L），然后和樣品緩沖液按1︰1混合，按體積分?jǐn)?shù)為10%的比例加入巰基乙醇，將樣品煮沸3 min，備用。

（3）電泳：將樣品加入制好的膠內(nèi)，上樣量為10μL，分子量范圍為14.4～97.4 ku。80 V恒壓，當(dāng)電泳條帶跑出濃縮膠和分離膠分界面后110 V恒壓。

（4）染色、脫色。將跑好的膠放入制好的染色液中，染色2 h，倒掉染色液，用PBS沖洗兩次，然后加入脫色液，每隔2 h更換1次脫色液，直至條帶清晰，約需12 h。

3 結(jié)果與討論

3.1 根據(jù)蛋白分離純化峰收集β-Lg

圖2為β-Lg的樣品峰；圖3為標(biāo)樣峰。由圖2和圖3可以看出，對(duì)應(yīng)標(biāo)樣峰中的出峰體積，可以確定此峰為β-Lg的峰，而且此峰周?chē)鷰缀鯖](méi)有雜峰，便于收集。收集此峰，然后將收集的樣品進(jìn)行冷凍干燥，這一步是為了濃縮，然后進(jìn)行脫鹽。

3.2 脫鹽

圖4為β-Lg的脫鹽峰。圖4中，左峰是對(duì)應(yīng)的β-Lg的峰，右邊的電導(dǎo)峰對(duì)應(yīng)的是鹽類(lèi)。由圖4可以看出，所使用的脫鹽柱子可以將β-Lg和鹽完全分開(kāi)，并且經(jīng)過(guò)第一步以后β-Lg沒(méi)有雜峰，是非常純的。將脫鹽后的樣品再冷凍干燥，所得樣品即為β-Lg的分離物。

圖4 脫鹽峰

3.3 BCA試劑盒測(cè)定的結(jié)果

將所測(cè)得的β-Lg平均讀數(shù)0.642帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程中，計(jì)算β-Lg的質(zhì)量濃度為0.7137 g/L，根據(jù)β-Lg原樣品質(zhì)量濃度為1 g/L，可知其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.37%。

3.4 SDS-PAGE分析蛋白純度結(jié)果分析

圖5為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。

圖5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖5中，左邊為標(biāo)準(zhǔn)蛋白（marker），從上到下分別為兔磷酸化酶B（97.4 ku），牛血清白蛋白（66.2 ku），兔肌動(dòng)蛋白（43.0 ku），牛碳酸酐酶（31.0 ku），胰蛋白酶抑制劑（20.1 ku），雞蛋清溶菌酶（14.4 ku）；右邊為β-Lg。

由圖5可以看出，此方法所提取的β-Lg是非常純的，沒(méi)有雜峰，由此也知道上面BCA方法測(cè)定的蛋白中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.37%，剩余的物質(zhì)基本是分離純化后的鹽類(lèi)，雜蛋白很少，可以忽略。

4 結(jié) 論

本研究介紹了一種簡(jiǎn)單的方法從WPC中提取β-Lg，并用蛋白分離純化將粗提的β-Lg進(jìn)一步提純，然后脫鹽凍干，得到的即是比較純的β-Lg。然后是利用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，又利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢測(cè)β-Lg的純度。

傳統(tǒng)的方法是[15]：將鮮牛乳離心去除脂肪，下層即為脫脂乳；然后凝乳，等電點(diǎn)沉淀法去除酪蛋白；最后是鹽析，用硫酸按鹽析法按飽和度將乳清蛋白沉淀下來(lái)，再將鹽析后的乳清蛋白透析，然后再除鹽。此方法的缺點(diǎn)是操作比較粗，提取出來(lái)的β-Lg純度不夠，雜蛋白質(zhì)量濃度高，而且大家用凱式定氮法測(cè)量蛋白質(zhì)量濃度，由于其使用了硫酸銨，所測(cè)得的含氮量會(huì)偏高。

本文根據(jù)分離純化標(biāo)樣中對(duì)應(yīng)分子量的峰確定粗提的β-Lg中所要收集的峰，這一步可以使粗提的β-Lg進(jìn)一步純化，脫鹽過(guò)程又使得純化β-Lg中的鹽類(lèi)降到最低，這兩個(gè)步驟使得最終的β-Lg純度達(dá)到最高。

利用BCA法測(cè)定上述步驟中得到的β-Lg中的蛋白質(zhì)量濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其結(jié)果為713.7g/L，此值說(shuō)明蛋白質(zhì)量濃度較高，此方法是一種純度非常高的β-Lg分離方法。

從SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果可以看出，經(jīng)過(guò)分離純化后的β-Lg的電泳條帶只有18.3 ku處的一條帶，沒(méi)有其他的雜帶，說(shuō)明β-Lg純度非常高。

綜合本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本實(shí)驗(yàn)使用的提取方法，能夠提取出純度非常高的β-Lg，而且操作簡(jiǎn)單，所需的儀器藥品都是常規(guī)使用的，價(jià)格都不高，所以成本比較低，適合一般實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行中小規(guī)模的分離提取。

[1]HORTON B.Wheys of Recovery[J].Dairy Industry International,1996,61（5）：39-40.

[2]MAILLIART P,RIBADEAU-DUMAS B.Preparation of B-Lactoglobulin and B-Lactoglobulin Free Proteins from Whey Retentate by NaCl Salting Out at Low Ph[J].Journal of Food Science,1988，53：743-745.

[3]MATE H J,KROCHTA J M.B-Lactoglobulin Separation from Whey Protein Isolate on a Large-Scale[J].Journal of Food Science,1994，59：1111-1114.

[4]CAESSENS,P W J R,VISSER,S,GRUPPEN H.Method for the Isolation of Bovine B-Lactoglobulin From a Cheese Whey Protein Fraction and Physicochemical Characterization of the Purified Product[J].International Dairy Journal,1997，7：229-35.

[5]OUTINEN,TOSSAVAINEN,，SYY?OJA.Chromatographic Fractionation of A-Lactalbumin and B-Lactoglobulin with Polystyrenic Strongly Basic Anion Exchange Resins[J].Lebensmittel-Wissenschaft Und-Technologie,1996，29：340-343.

[6]KRISTIANSEN K R,OTTE J,IPSEN,R,et al.Large-Scale Preparation of B-Lactoglobulin a and B by Ultrafiltration and Ion-Exchange Chromatography[J].International Dairy Journal,1998，7：805-812.

[7]BOBE G,BEITZ D C,FREEMAN A E,et al.,Separation and Quantification of Bovine Milk Proteins by Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography[J].J Agric Food Chem，1998，46：458–463.

[8]BORDIN G,CORDEIRO F，RAPOSO B，et al.Identification and Quantification of Major Bovine Milk Proteins by Liquid Chromatography[J].J Chromatogr，2001，928：63-76.

[9]B MANJI,A HILL,Y KAKUDA,DM IRVINE,Rapid Separation Of Milk Whey Proteins By Anion Exchange Chromatography,J.Dairy Sci.1985，68：3176-3179.

[10]SK BASAK,A VELAYUDHAN,K KOHLMANN,et al.,ElectrochromatographicSeparationOfProteins,J.Chromatogr.A 1995，707：69-76.

[11]GODOVAC-ZIMMERMANN J,KLOSTERMEYER H,Isolation And Rapid Sequence Characterization Of Two Novel Bovine BLactoglobulins I And J[J].J Protein Chem，1996，15：743-750.

[12]WAL J M,BERNARD H,YVON M,et al.Enzyme Immunoassay of Specific Human IgE to Purified Cow’s Milk Allergens[J].Food&Agricultural Immunology,1995，7：175-187.

[13]ROWLAND S J.The Protein Distribution in Normal and Abnormal Milk[J].Journal of Dairy Research,1938，9：47-57.

[14]MAILLIART P,RIBADEAU-DUMAS B.Preparation of B-Lactoglobulin and B-Lactoglobulin Free Proteins from Whey Retentate By NaCl Salting Out at Low pH[J].Journal of Food Science,1988，53：743-745.

[16]喬秉善.變態(tài)反應(yīng)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2002：98-100.

Separation β-lactoglobulin from WPC

DUAN Cui-cui,HUO Gui-cheng,REN Da-xi,FENG Fang-fei
（Key Lab of Dairy Science,Education Ministry，F(xiàn)ood College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

β-Lactoglobulin（β-Lg）is the major protein in whey,several methods for isolating β-Lg have been described.However,none of the existing processes or techniques has been effectively implemented to achieve inadequate yield/purification.The aim of this study was to introduce a simple,reproducible,and less expensive method to isolate β-Lactoglobulin from whey protein concentrate.Moreover,the use of BCA protein concentration determination shows that the concentration of extracted β-Lg is very high,while the SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）result shows that the extracted β-lg has a high purity.

protein purification；β-Lactoglobulin；SDS-PAGE

TS252～59

A

1001-2230（2010）01-0019-04

2009-05-17

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物乳業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目（CXT 007-2）。

段翠翠（1984-），女，碩士，從事食品科學(xué)方面的研究。

霍貴成