張子健，劉玉恩，趙謙，張柏林

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

植物乳桿菌C8-1產(chǎn)類細菌素的初步研究

張子健，劉玉恩，趙謙，張柏林

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

從發(fā)酵2周的泡菜中分離到66株乳桿菌，以其中4株乳桿菌作為出發(fā)菌株進行紫外誘變處理得到一株產(chǎn)類細菌素的突變株C8-1?；诩毎螒B(tài)、生理生化和16S rDNA測序數(shù)據(jù)，菌株C8-1被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。菌株C8-1所產(chǎn)的類細菌素具有較寬的抑菌譜，能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等多種食品腐敗菌和致病菌；有較好的熱穩(wěn)定性，在4℃冷藏5 d和-20℃冷凍5 d以及60，80，100℃和121℃分別加熱15 min，活性損失均不超過6%；且抑菌活性隨pH值增大逐步降低，當(dāng)pH≥6時，抑菌活性消失，對胃蛋白酶、木瓜蛋白酶耐受性較強，對胰蛋白酶較為敏感。這些數(shù)據(jù)表明，產(chǎn)類細菌素的植物乳桿菌C8-1在食品加工中具有進一步地潛在應(yīng)用價值。

類細菌素；植物乳桿菌；抑菌特性

0 引 言

在代謝過程中，乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）除了能夠產(chǎn)生乳酸、乙酸及過氧化氫以外，還可以產(chǎn)生具有抑菌或殺菌作用的蛋白類物質(zhì)——細菌素[1-5]。鑒于乳酸菌產(chǎn)生的細菌素具備高效、體內(nèi)無殘留、無抗藥性及不污染環(huán)境等特點，近年來被推薦作為生物型的防腐劑用于食品的保藏當(dāng)中[6]。本研究從發(fā)酵2周后的泡菜分離篩選到能夠產(chǎn)生廣譜抑菌的產(chǎn)細菌素植物乳桿菌菌株，經(jīng)UV誘變處理得后到一株產(chǎn)高效細菌素的植物乳桿菌C8-1，對其所產(chǎn)生的細菌素部分特性進行了研究，以下是部分結(jié)果，旨在為尋求能夠潛在用于乳品保存的生物型防腐介質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗菌株：從發(fā)酵兩周后的泡菜中共分離出66株乳桿菌，現(xiàn)由北京林業(yè)大學(xué)工業(yè)微生物菌種保藏室（BJFU）凍干保藏。指示菌菌株及來源：抑菌譜中所用菌株見表5。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院提供；其他指示菌均由北京林業(yè)大學(xué)工業(yè)微生物菌種保藏室提供。

1.2 抑菌活性檢測[7]

本研究采用單層瓊脂平板打孔法，即在無菌平皿中加入濃度約107mL-1的指示菌菌懸液1 mL，倒入約20 mL的MRS培養(yǎng)基，混合均勻，放置30 min，打孔（直徑6.8 mm）。分別向孔內(nèi)加入等量的抑制菌離心發(fā)酵上清，37°C培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量抑菌圈的直徑。

1.3 菌種的篩選

1.3.1 乳酸菌的分離

在無菌操作臺中吸取發(fā)酵后期的泡菜汁進行10倍梯度稀釋，分別取0.1 mL稀釋度為10-5～10-7的泡菜汁于培養(yǎng)皿，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的CaCO3的MRS培養(yǎng)基倒平板，混勻，37℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣圈的單個菌落進行鏡檢，選取革蘭氏陽性菌接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，備用。

1.3.2 指示菌和擬產(chǎn)類細菌素菌株的篩選[8，9]

采用單層瓊脂平板打孔法對分離的所有乳酸菌進行兩兩相交拮抗，能夠?qū)Υ蟛糠志戤a(chǎn)生明顯抑菌圈的菌株選定為擬產(chǎn)類細菌素菌株，同時以金黃色葡萄球菌作為指示菌，進行抑菌試驗。

1.3.3 紫外誘變擬產(chǎn)類細菌素菌株[10]

將培養(yǎng)至對數(shù)期的擬產(chǎn)細菌素菌株進行轉(zhuǎn)速為12000 r/min，4°C離心5 min， 用生理鹽水洗兩次，進行10倍梯度稀釋，選取10-5～10-7稀釋度的菌液分別吸取1 mL涂布于MRS固體平板上，于黑室內(nèi)無菌操作臺中的紫外燈下進行誘變。紫外燈功率15W，照射距離30 cm，照射時間30 s，避光倒置培養(yǎng)48 h。每株出發(fā)菌誘變后達到75%～90%致死率時，從誘變平板分別挑取5個單一突變株菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，離心發(fā)酵液，取上清。分別以各自出發(fā)菌株做參比，以金黃色葡萄球菌做指示菌，做抑菌實驗，挑選抑菌圈有明顯增大的突變菌株為后續(xù)試驗菌株。

1.3.4 產(chǎn)類細菌素菌株的確定[11]

（1）排除有機酸實驗。將挑選的突變菌株以體積分?jǐn)?shù)為1%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h， 發(fā)酵液經(jīng)轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，4°C離心20 min，將所得上清液的pH值調(diào)至5.0，并用pH值為5.0的乳酸作對照，以篩選的敏感指示菌做抑菌實驗，比較抑菌效果。

（2）排除H2O2實驗。將挑選的突變株以體積分?jǐn)?shù)為1%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min，4°C離心20 min，再于80°C加熱10 min以使H2O2快速分解，用篩選的敏感指示菌做抑菌試驗，比較處理前后抑菌圈變化情況。

（3）硫酸銨鹽析產(chǎn)物的抑菌實驗。將挑選的突變株以體積分?jǐn)?shù)為1%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min，4 C離心5 min去除菌體。將離心后的發(fā)酵液進行40%～70%的梯度鹽析，4°C靜置過夜。次日取出后12 000 r/min，4°C離心20 min，將沉淀復(fù)溶于3 mL濃度為0.02 mol/L（pH值為5.0）的檸檬酸鹽緩沖液中，制成鹽析蛋白液。以敏感指示菌做抑菌試驗，以未經(jīng)鹽析處理的突變株離心發(fā)酵上清液、70%飽和度的（NH4）2SO4溶液和pH值為5.0的檸檬酸鹽緩沖液作對照。觀察蛋白鹽析物的抑菌情況，參比對照確定產(chǎn)類細菌素菌株。

1.4 產(chǎn)類細菌素菌株的鑒定

生理生化鑒定參閱文獻[12-14]。

產(chǎn)類細菌素菌株16S rDNA序列同源性分析鑒定：產(chǎn)類細菌素菌株的16S rDNA擴增及序列測定均委托寶生物工程有限公司進行。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化測序得到的PCR序列在GeneBank中利用BLAST程序進行同源性比較。

1.5 產(chǎn)類細菌素菌株的抑菌特性

1.5.1 抑菌譜

選取植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單孢菌、黃桿菌、鞘氨醇桿菌等18株菌為指示菌，用產(chǎn)細菌素菌株的離心發(fā)酵上清液做抑菌試驗，確定其抑菌范圍。

1.5.2 溫度穩(wěn)定性試驗

取產(chǎn)細菌素菌株的離心發(fā)酵上清液分裝于不同的試管中，分別于60°C，80°C，100°C，120°C條件下分別處理15 min，4°C和-20°C分別處理5 d,以不做處理的離心發(fā)酵上清作對照，以鞘氨醇桿菌為指示菌進行抑菌試驗，比較抑菌效果的變化情況，確定該細菌素的溫度穩(wěn)定性。

1.5.3 pH值穩(wěn)定性實驗

用濃度為1 mol/L為HCl溶液或濃度為2 mol/L的NaOH溶液調(diào)產(chǎn)細菌素菌株離心發(fā)酵上清液的pH值分別至3，4，5，6，7，8，9，10； 以不做處理的離心發(fā)酵上清液做對照，以鞘氨醇桿菌為指示菌做抑菌試驗，比較抑菌效果的變化情況，確定該細菌素在不同環(huán)境pH值條件下的穩(wěn)定性。

1.5.4 蛋白酶敏感性實驗

將胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶分別配制成質(zhì)量濃度為5 g/L溶液，調(diào)胃蛋白酶液pH值至2.0～3.0，木瓜蛋白酶液pH值為6.0，胰蛋白酶液pH值為7.8。酶液與離心發(fā)酵上清均37℃預(yù)熱1 h。分別取1 mL酶液于試管中，再分別加入4 mL產(chǎn)細菌素菌株的離心發(fā)酵上清液，使最終酶質(zhì)量濃度為1 g/L，37℃水浴4 h進行反應(yīng)。以鞘氨醇桿菌為指示菌，以未經(jīng)處理的離心發(fā)酵上清液為對照，進行抑菌實驗。比較抑菌效果的變化情況，確定該細菌素在不同酶處理條件下的敏感性。

1.6 試驗中的數(shù)據(jù)處理

試驗中所有抑菌圈直徑（mm）均垂直測量兩次，取兩次測量的平均值，最后取3組平行測量值的平均值，所得結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件進行差異顯著性分析，顯著性水平均取5%（P﹤0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

自泡菜中共篩選到119株乳酸菌，其中球菌53株，桿菌66株，鏡檢均為革蘭氏陽性。其菌落為乳白色或略顯黃色，菌落凸起，光滑、濕潤，邊緣整齊，符合乳酸菌菌落特征。

2.2 指示菌與擬產(chǎn)細菌素菌株的篩選

通過對66株乳酸菌以單層瓊脂平板打孔法進行相互抑制試驗，選取對多數(shù)乳酸菌有抑制作用的乳酸桿菌C8，C10，C18，C25為擬產(chǎn)細菌素菌株， 選擇對多數(shù)乳酸菌敏感的乳酸桿菌C6。如表1所示，以乳酸桿菌C6和金黃色葡萄球菌為指示菌作指示菌進行抑菌試驗，4株擬產(chǎn)細菌素菌株均顯示抑菌性。

表1 擬產(chǎn)細菌素菌株的抑菌作用

2.3 4株擬產(chǎn)細菌素菌株的紫外誘變

4株擬產(chǎn)細菌素菌株經(jīng)紫外誘變培養(yǎng)后分別在UV照射平板上挑取單一菌落進行抑菌試驗，僅篩選到C8的誘變菌株C8-1和C10的誘變菌株C10-2抑菌活性大于出發(fā)菌株，如表2所示，因此后續(xù)實驗以C8-1和C10-2為抑制菌株進行。乳酸桿菌C8經(jīng)紫外誘變后活菌計數(shù)檢測結(jié)果為1.04×108mL-1，對照平板計數(shù)結(jié)果為4.19×108mL-1，致死率為75.2%。

表2 誘變菌株的抑菌效果

2.4 產(chǎn)細菌素菌株的確定

2.4.1 酸中和實驗

如表3所示，乳酸桿菌C8-1和C10-2離心后的發(fā)酵上清液被中和至pH值為5.0后，均有明顯抑菌效果，而作為對照的pH值為5.0的乳酸并沒有產(chǎn)生抑菌圈。此結(jié)果說明發(fā)酵上清液中除乳酸外還存在其它抑菌活性物質(zhì)。

表3 中和有機酸后的抑菌效果

2.4.2 排除過氧化氫實驗

如表4所示，乳酸桿菌C8-1和C10-2的離心發(fā)酵上清液經(jīng)80°C水浴加熱處理10 min，使過氧化氫充分分解后，以乳酸桿菌C6做指示菌進行抑菌試驗，測量的抑菌圈直徑基本沒有變化，說明主要抑菌物質(zhì)不是過氧化氫。

2.4.3 硫酸銨鹽析產(chǎn)物的抑菌實驗

乳酸桿菌C8-1和C10-2分別進行40%～70%硫酸銨分段鹽析，離心得到的蛋白以3 mL濃度為0.02 mol/L（pH值為5.0）的檸檬酸鹽緩沖液（Citrate Buffer，CB）溶解后，以乳酸桿菌C6做指示菌進行抑菌實驗。實驗結(jié)果顯示只有菌株C8-1的鹽析蛋白有抑菌作用。作為對照的70%飽和度的硫酸銨溶液和濃度為0.02 mol/L檸檬酸鹽緩沖液均沒有抑菌活性。由此確定乳酸桿菌C8-1為產(chǎn)細菌素菌株，如圖1所示。

表4 排除過氧化氫后的抑菌效果

圖1 C8-1鹽析產(chǎn)物抑菌

2.5 產(chǎn)細菌素菌株鑒定

2.5.1 菌體形態(tài)

乳酸菌C8-1于MRS固體培養(yǎng)基時均為微小，凸起，圓形，光滑，乳白色菌落形態(tài)，菌落直徑2～3 mm。鏡檢均為革蘭氏陽性桿菌，菌體兩端鈍圓，單個或成對排列。

2.5.2 生理生化鑒定

測試表明，菌株C8-1在10℃生長，45℃不生長；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.5%NaCl的MRS培養(yǎng)基中生長；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%和18%NaCl的MRS培養(yǎng)基中不生長；在pH值為4和9的MRS中均生長；其過氧化氫酶實驗陰性，不從精氨酸產(chǎn)氨，不水解淀粉。對18種糖醇進行糖發(fā)酵試驗表明，菌株C8-1不能利用鼠李糖，阿拉伯糖反應(yīng)為弱陽性，菌株C8-1的松三糖反應(yīng)為弱陽性，其余反應(yīng)均為陽性。根據(jù)以上特性，參閱文獻[12-14]，乳酸菌C8-1被初步鑒定為植物乳桿菌。

2.5.3 16SrDNA序列同源性分析

將菌株C8-1的16S rRNA序列在NCBI上用Blast程序進行同源性搜索，比對結(jié)果表明，C8-1與植物乳桿菌WCFS1（NC_004567.1）的16S rRNA序列同源性達到99%。結(jié)合細胞形態(tài)和生理生化實驗，乳桿菌C8-1被鑒定為植物乳桿菌。目前，植物乳桿菌C8-1已提交到NCBI， 其Genebank accession Number是FJ378889，該菌株現(xiàn)由北京林業(yè)大學(xué)生物學(xué)院食品系保存（菌株資源平臺編號：1511C0016000000302；菌株保藏編號：BJFU 1.0182）。

2.6 植物乳桿菌C8-1的抑菌譜

抑菌譜如表5所示。以18株菌為指示菌做抑菌譜發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌C8-1所產(chǎn)的細菌素只對其中的4株乳酸菌不產(chǎn)生抑制作用，對其它菌株均有抑制效果，具有廣泛的抑菌作用。值得注意的是，該細菌素不僅對乳酸菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有抑制作用，而且對革蘭氏陰性的大腸桿菌、黃桿菌、鞘氨醇桿菌和假單孢菌抑制性極強。

表5 植物乳桿菌C8-1所產(chǎn)細菌素的抑菌譜

2.2 細菌素的理化特性

2.2.1 溫度穩(wěn)定性

植物乳桿菌C8-1的離心發(fā)酵上清液經(jīng)溫度為60，80，100，121℃分別處理15 min；4℃和-20℃分別貯藏5d，以鞘氨醇桿菌PF11做指示菌進行抑菌實驗，比較抑菌圈變化。

由表6可見,在60～121°C范圍內(nèi)，隨溫度的不斷增加類細菌素活性逐步降低，121°C處理15 min后抑菌效果降低幅度最大，達到5.4%。4°C處理5 d后抑菌效果基本沒有變化,而-20°C處理5d后抑菌效果降低幅度最大，達到5.76%。由此可見，不同溫度處理后該類細菌素的抑菌活性降低不超過6%，相當(dāng)穩(wěn)定，因此判定該類細菌素在高溫和冷凍冷藏處理時都具有較好的穩(wěn)定性。

表6 類細菌素的溫度穩(wěn)定性

2.2.2 pH值穩(wěn)定性

將植物乳桿菌C8-1的離心發(fā)酵上清液的pH值分別調(diào)至3，4，5，6，7，8，9，10； 以鞘氨醇桿菌PF11為指示菌做抑菌實驗，比較抑菌圈大小的變化，結(jié)果如圖2所示。

試驗結(jié)果顯示，該類細菌素在pH值為3～5范圍內(nèi)，抑菌活性隨pH值升高而逐漸降低，在pH值為6～10范圍內(nèi)，類細菌素活性為零。該類細菌素在pH值為5.0時的抑菌活性比pH值為3.0時下降39.62%，由此確定該類細菌素僅在酸性條件下具有抑菌活性，pH≥6時失活。

圖2 類細菌素的pH值穩(wěn)定性

2.2.3 蛋白酶穩(wěn)定性

以胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶分別處理菌株C8-1的離心發(fā)酵上清液，以鞘氨醇桿菌PF11為指示菌進行抑菌試驗，以不作處理的離心上清液作對照，比較抑菌圈大小的變化。

試驗結(jié)果表明，該類細菌素經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶分別處理后，活性均有所降低，說明該類細菌素確系蛋白類物質(zhì)。該類細菌素對胰蛋白酶最敏感，抑菌圈從處理前的24.06 mm下降為20.69 mm，抑菌活性降低14%。

表7 類細菌素對蛋白酶的穩(wěn)定性

3 結(jié)束語

植物乳桿菌C8-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對胰蛋白酶敏感，能明顯抑制G-菌的生長，屬于蛋白類抑菌物質(zhì)。該菌株產(chǎn)生的類細菌素物質(zhì)具有活性高、耐高溫、在酸性條件下穩(wěn)定等特點，有較寬的抑菌譜，能夠抑制常見食源性腐敗菌和致病菌，表明該類細菌素在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡以及延長食品貨架期等方面有一定的應(yīng)用潛力。

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Preliminary characterization of bacteriocin-like substance formed by Lactobacillus plantarum C8-1

ZHANG Zi-jian,LIU Yu-en,ZHAO Qian,ZHANG Bo-lin
（College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China）

Among 66 isolates of Lactobacillus from traditional Chinese vegetables fermented for two weeks,four isolates were induced by UV light for producing bacteriocin.From these four lactobacilli strains,the mutant C8-1 was proved to produce proteins able to have antibacterial activity.Strain C8-1 was further identified as Lactobacillus plantarum according to its cell morphology,physiological-biochemistry and 16S rDNA data.Bacteriocin-like substance produced by strain C8-1 had a wide antibacterial spectrum which inhibited food spoiled and pathogenic bacteria.It showed good stability within a wide range of temperatures.When refrigerated at 4°C or frozen at-20°C for 5d as well as treated at 60°C,80°C,100°C or 121°C for 15min,the activity loss of the bacteriocin was less than 6%.Its antibacterial activity decreased with gradually evaluated pH,and disappeared when pH was higher than 6.The bacteriocin was resistant to pepsin and papain,but highly sensitive to trypsin.The present information shows that Lactobacillus plantarum C8-1 should be very potential for use as biological control agent in food processing and dairy products.

Bacteriocin,Lactobacillus plantarum,antibacterial properties

Q93-33

A

1001-2230（2010）01-0015-04

2009-09-16

本研究由國家高新技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2006AA10Z344）、國家科技基礎(chǔ)條件平臺 “工業(yè)微生物菌種資源”項目（2005DKA21204-12）資助。

張子健（1984-），女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

張柏林