邵淑娟，曾慶真，朱麗君，楊貞耐

（1.菏澤市行政審批服務(wù)局，山東菏澤 274000；2.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東菏澤 274000；3.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京工商大學(xué)，北京 100048）

凝乳酶（Chymosin，EC 3.4.23.4）是重要的工業(yè)用酶之一，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。在干酪制作過(guò)程中，它主要起著凝固牛乳、改善風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)、影響干酪得率等作用[1]。傳統(tǒng)凝乳酶最初來(lái)源于未斷奶的小牛皺胃，而隨著世界干酪及干酪素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其供應(yīng)已不能滿(mǎn)足現(xiàn)代生產(chǎn)所需[2]。因此，研究學(xué)者進(jìn)行大量研究從動(dòng)植物或微生物中尋找最具發(fā)展?jié)摿Φ哪槊?。其中，微生物具有易培養(yǎng)、生長(zhǎng)周期短、受地域氣候時(shí)間限制小等特性，用其生產(chǎn)凝乳酶成本低、經(jīng)濟(jì)效益高、酶提取方便，因此與動(dòng)植物相比最具發(fā)展前途[3]。從現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道可知，目前產(chǎn)生凝乳酶的微生物主要有毛霉、曲霉、根霉及細(xì)菌類(lèi)等[4-5]。其中，由微小毛霉產(chǎn)生的凝乳酶較大部分蛋白分解酶的蛋白分解能力弱，對(duì)牛乳凝固作用強(qiáng)，安全無(wú)毒，因而成為目前微生物凝乳酶應(yīng)用最多的菌種之一[6]。

本實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)篩選培育得到一株高產(chǎn)凝乳酶的微小毛霉菌株，菌株編號(hào)為G-3。因此，本文在前期對(duì)微小毛霉（G-3）凝乳酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行詳細(xì)研究，為高效率、低成本產(chǎn)生凝乳酶提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

微小毛霉（G-3）由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心選育與保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.3 g、KH2PO40.05 g、麩皮15 g、去離子水25 mL。

1.1.3 試劑

脫脂乳粉，新西蘭Fonterra公司；乙醇、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉（SDS），北京化工廠有限責(zé)任公司；金屬鹽類(lèi)，汕頭市西隴化工有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱，中國(guó)哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Eletron公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；數(shù)顯pH計(jì)，德國(guó)Sartorious公司。

1.3 方法

1.3.1 微小毛霉凝乳酶酶液的制備

向微小毛霉（G-3）固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入100 mL的氯化鈉溶液（4%），攪拌后于恒溫振蕩箱上（30 ℃）以150 r/min的轉(zhuǎn)速浸提4 h。之后用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾得該凝乳酶的粗酶液。向粗酶液中加入60%的乙醇溶液于4 ℃條件下沉淀4 h后，以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min（4 ℃）。將沉淀用pH為5.8的磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L）溶解即得用于以下凝乳活力測(cè)定的凝乳酶酶液。

1.3.2 凝乳活力測(cè)定

用CaCl2（0.01 mol/L）溶液將脫脂乳粉配制成的脫脂乳液（10%），準(zhǔn)確量取35 ℃水浴10 min下的待測(cè)酶液0.2 mL及脫脂乳液2 mL，兩者迅速充分混勻后開(kāi)始計(jì)時(shí)，至絮狀沉淀出現(xiàn)為終點(diǎn)。凝乳活力計(jì)算公式見(jiàn)式（1），相對(duì)凝乳活力計(jì)算公式見(jiàn)式（2）：

式（1）中：t為凝乳時(shí)間，單位為s；n為稀釋倍數(shù)。式（2）中：A為所測(cè)凝乳活力，單位為SU/mL；A0為對(duì)照凝乳活力，單位為SU/mL。

1.3.3 不同溫度對(duì)凝乳酶活力的影響及凝乳酶的熱穩(wěn)定性

將待測(cè)酶液分別在20～80 ℃條件下水浴10 min后，根據(jù)1.3.2的方法測(cè)定凝乳活力。以最高凝乳活力項(xiàng)為對(duì)照記為100%，以研究該凝乳酶的最適凝乳溫度。

將待測(cè)酶液分別在35 ℃、45 ℃、55 ℃和60 ℃條件下水浴 15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、240 min、300 min和360 min，迅速降溫并于35 ℃水浴10 min后，根據(jù)1.3.2的方法測(cè)定剩余凝乳活力。以最高凝乳活力項(xiàng)為對(duì)照記為100%，以研究該凝乳酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.4 不同pH對(duì)凝乳酶活力的影響及凝乳酶的pH穩(wěn)定性

用0.1 mol/L的NaOH溶液及0.1 mol/L的HCl溶液將待測(cè)酶液的pH分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0后，根據(jù)1.3.2的方法測(cè)定凝乳活力。以最高凝乳活力項(xiàng)為對(duì)照記為100%，以研究該凝乳酶的最適凝乳pH。

用0.1 mol/L的NaOH溶液及0.1 mol/L的HCl溶液將待測(cè)酶液的pH分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，4 ℃避光放置24 h后，將待測(cè)酶液pH調(diào)至5.97（原待測(cè)酶液pH值），根據(jù)1.3.2的方法測(cè)定凝乳活力。以最高凝乳活力項(xiàng)為對(duì)照記為100%，以研究該凝乳酶的pH穩(wěn)定性。

1.3.5 不同乳液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)凝乳酶活力的影響

取待測(cè)溶液分別加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%和20.0%的脫脂乳液中，根據(jù)1.3.2的方法測(cè)定凝乳活力。以最高凝乳活力項(xiàng)為對(duì)照記為100%，以研究不同乳液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)凝乳酶活力的影響。

1.3.6 不同金屬離子種類(lèi)及濃度對(duì)凝乳酶活力的影響

在脫脂乳液中分別加入 NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、FeCl3、ZnCl2、FeCl2、CoCl2、MnSO4、K2SO4、NiSO4、Li2SO4、CuSO4、MgSO4和ZnSO4等金屬鹽類(lèi)，使其濃度均為5 mmol/L，加入待測(cè)酶液室溫靜置30 min后根據(jù)1.3.2的方法測(cè)定凝乳活力。以未添加任何金屬鹽類(lèi)的脫脂乳液測(cè)得的凝乳活力為對(duì)照記為100%，計(jì)算其相對(duì)凝乳活力。

挑選能顯著促進(jìn)凝乳酶活力的金屬鹽類(lèi)，并分別調(diào)整濃度為0 mol/L、0.001 mol/L、0.005 mol/L、0.010 mol/L、0.015 mol/L、0.02 mol/L和0.025 mol/L，加入待測(cè)酶液室溫靜置30 min后根據(jù)1.3.2的方法測(cè)定凝乳活力。以未添加任何金屬鹽類(lèi)的脫脂乳液測(cè)得的凝乳活力為對(duì)照記為100%，計(jì)算其相對(duì)凝乳活力。

1.3.7 不同有機(jī)溶劑種類(lèi)及溶度對(duì)凝乳酶活力的影響

在脫脂乳液中分別加入不同濃度的乙醇溶液（1%、2%、3%、4%和5%）、β-巰基乙醇溶液（1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L和7 mmol/L）及SDS溶液（1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L和4 mmol/L），加入待測(cè)酶液室溫靜置30 min后根據(jù)1.3.2的方法測(cè)定凝乳活力。以未添加有機(jī)溶劑的脫脂乳液測(cè)得的凝乳活力為對(duì)照記為100%，計(jì)算其相對(duì)凝乳活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以上所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值以及標(biāo)準(zhǔn)差采用Microsoft Excel 2019處理，并通過(guò)Origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微小毛霉凝乳酶的最適凝乳溫度及熱穩(wěn)定性分析

溫度主要影響酪蛋白膠束表面電荷而影響凝乳酶的凝乳活力[7]。如圖1所示，在20～65 ℃，隨著溫度升高，膠束表面電荷減少，聚集作用增強(qiáng)，凝乳酶的活力也逐漸增加。當(dāng)溫度高于65 ℃時(shí)，凝乳活力明顯下降，到80 ℃時(shí)，相對(duì)凝乳活力僅為7.76%。因此，該微小毛霉凝乳酶的最適作用溫度為65℃。

圖1 不同溫度對(duì)凝乳酶活力的影響

凝乳酶的熱穩(wěn)定性可決定干酪加工、成熟過(guò)程中凝乳酶的殘余量，并可進(jìn)一步影響干酪成品的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)。從圖2可看出，隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，各溫度下凝乳酶的凝乳活力均呈一定程度的下降趨勢(shì)。該酶在35～45 ℃有較高熱穩(wěn)定性，此區(qū)間水浴150 min，相對(duì)凝乳活力仍在85%以上。但隨著溫度的升高，凝乳活力明顯降低。當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃，水浴150 min后，相對(duì)凝乳活力僅為63.46%，溫度達(dá)到60 ℃，水浴120 min，凝乳酶蛋白變性完全失活。該凝乳酶在55 ℃后的熱不穩(wěn)定性，在干酪后期制作過(guò)程中對(duì)凝乳酶的滅活有較大幫助。

圖2 凝乳酶的熱穩(wěn)定性

2.2 微小毛霉凝乳酶的最適pH及pH穩(wěn)定性分析

pH的變化可影響凝乳酶的空間結(jié)構(gòu)及凝乳酶活性中心的解離形式，從而影響酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)導(dǎo)致凝乳活力改變[8]。由圖3所示，凝乳酶在pH為5.0時(shí)，表現(xiàn)出最強(qiáng)的凝乳活力，隨著凝乳酶所處環(huán)境由弱酸性轉(zhuǎn)到偏中性時(shí)，凝乳活力下降極快。當(dāng)凝乳酶處于中性條件時(shí)，相對(duì)凝乳活力僅為對(duì)照的20.51%，處于偏堿性條件時(shí)，由于凝乳酶的空間結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的變化使得凝乳活力幾乎完全喪失。因此，該凝乳酶的最適凝乳pH為5.0，在此pH條件下，凝乳酶、脫脂乳液的存在狀態(tài)可能最適合彼此相互結(jié)合，發(fā)生催化反應(yīng)，從而使凝乳活力達(dá)到最大值。

圖3 不同pH對(duì)凝乳酶活力的影響

有研究顯示在偏酸性條件下，酪蛋白的疏水性增強(qiáng)，膠束易解離，從而使酪蛋白聚集產(chǎn)生凝乳[9]。由圖4可看出，凝乳酶在弱酸性（pH=4～6）條件下，凝乳活力較穩(wěn)定，均保持在90%以上，其中在pH為6時(shí)酶最穩(wěn)定。pH過(guò)大（＞7）會(huì)造成凝乳活力較大損失，這可能是因?yàn)槟槊笇儆谒嵝缘鞍酌福诔掷m(xù)堿性條件下由于活力位點(diǎn)的電荷改變，凝乳酶不能有效與底物結(jié)合發(fā)生催化作用。因此可看出，該凝乳酶的耐酸能力比耐堿能力強(qiáng)，這一特性在干酪制作過(guò)程中具有一定優(yōu)勢(shì)。

圖4 凝乳酶的pH穩(wěn)定性

2.3 微小毛霉凝乳酶的最適底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

由圖5可知，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的脫脂乳液對(duì)凝乳酶的凝乳活力有較大影響。隨著乳液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，凝乳酶的相對(duì)凝乳活力逐漸降低，當(dāng)乳液質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到20%時(shí)，相對(duì)凝乳活力僅為23.6%。當(dāng)乳液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，該酶活力最強(qiáng)。而李玉秋等研究報(bào)道，凝乳酶的最適凝乳底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，與本研究結(jié)果不同，這可能是由于脫脂乳粉及凝乳酶的來(lái)源不同導(dǎo)致最適作用底物濃度也有所不同[10]。

圖5 不同乳液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)凝乳酶活力的影響

2.4 不同種類(lèi)及濃度的金屬離子對(duì)凝乳酶活力的影響

在干酪制造過(guò)程中，金屬離子具有防腐作用，并能改善干酪的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味及功能性。因此，選擇合適種類(lèi)和濃度的金屬離子可使凝乳酶發(fā)揮最佳的凝乳效果[11]。由圖6、7可知，Ca2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+分別對(duì)凝乳酶的活力有明顯促進(jìn)作用，其中以Mn2+、Mg2+、Ca2+的促進(jìn)作用最顯著。Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+分別對(duì)凝乳酶的活力有抑制作用，其中以Co2+、Ni2+的抑制作用最顯著。而Na+、K+、Li+對(duì)凝乳酶的活力作用較不明顯。本研究結(jié)果與其他研究報(bào)道略有差異，如潘道東等研究表明Cu2+和Zn2+對(duì)根霉凝乳酶有促進(jìn)作用[12]，李柳研究發(fā)現(xiàn)Mn2+對(duì)甲醇芽孢桿菌凝乳酶有抑制作用[1]，宋曦等研究表明Na+、Li+對(duì)地衣芽孢桿菌凝乳酶有抑制作用[8]。金屬離子對(duì)凝乳酶活力的影響較為復(fù)雜，不同來(lái)源的凝乳酶或反應(yīng)體系濃度不同，都可能導(dǎo)致金屬離子對(duì)凝乳酶活力作用產(chǎn)生差異。此外，通過(guò)分析比較相同濃度下的MgCl2溶液與MnSO4溶液、KCl溶液與K2SO4溶液對(duì)凝乳酶活力作用發(fā)現(xiàn)，SO42-比Cl-更能促進(jìn)凝乳酶的活力。

圖6 不同種類(lèi)金屬離子對(duì)凝乳酶活力的影響（含Cl-）

圖7 不同種類(lèi)金屬離子對(duì)凝乳酶活力的影響（含SO42-）

為了進(jìn)一步證明Mn2+、Mg2+、Ca2+對(duì)凝乳酶活力的促進(jìn)作用，考察了不同濃度下的Mn2+、Mg2+、Ca2+對(duì)凝乳酶凝乳活力的影響。從圖8可看出，隨著Mn2+、Mg2+濃度的增加，凝乳酶的相對(duì)凝乳活力均呈上升趨勢(shì)，且當(dāng)Mn2+、Mg2+濃度達(dá)到0.025 mol/L時(shí)，相對(duì)凝乳活力達(dá)到最大值。而隨著Ca2+濃度的增加，凝乳酶的相對(duì)凝乳活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)Ca2+濃度達(dá)到0.02 mol/L時(shí)，相對(duì)凝乳活力最高。

圖8 不同濃度金屬離子對(duì)凝乳酶活力的影響

2.5 有機(jī)溶劑對(duì)凝乳酶凝乳活力的影響

表1顯示，乙醇對(duì)凝乳酶活力有一定的抑制作用，且隨著其濃度的增加，抑制作用隨之增強(qiáng)。當(dāng)乙醇濃度為5%時(shí)，相對(duì)凝乳活力僅為對(duì)照的69.59%。這可能是由于乙醇的加入降低了脫脂乳液中蛋白質(zhì)的介電常數(shù)，從而降低了凝乳酶的凝乳活力。由表1可看出，SDS溶液作為一種蛋白變性劑對(duì)凝乳酶活力也有抑制作用，且比乙醇的抑制作用更強(qiáng)。當(dāng)SDS濃度為4 mmol/L時(shí)，相對(duì)凝乳活力僅為對(duì)照的21.46%。表1顯示，β-巰基乙醇對(duì)凝乳酶活力有明顯促進(jìn)作用，但這種促進(jìn)作用并不隨β-巰基乙醇濃度的變化而變化。β-巰基乙醇中的巰基在凝乳酶中可作為活性催化集團(tuán)的中心，同時(shí)與另一巰基形成二硫鍵，從而穩(wěn)定凝乳酶的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)凝乳酶的活力[13]。

表1 不同種類(lèi)及濃度的有機(jī)溶劑對(duì)凝乳酶活力的影響

3 結(jié)論

本文主要測(cè)定了在不同溫度、pH、乳液濃度、金屬離子、有機(jī)溶劑種類(lèi)及濃度等條件下微小毛霉（G-3）凝乳酶的相對(duì)凝乳活力。研究顯示，該凝乳酶的最適凝乳溫度為65℃，在35～45℃有較好熱穩(wěn)定性，此溫度區(qū)間保溫150 min，相對(duì)凝乳活力仍在85%以上。酶的最適凝乳pH為5.0，且此酶的耐酸能力比耐堿能力強(qiáng)，pH為6.0時(shí)酶最穩(wěn)定。凝乳酶的最適底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。Ca2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+可明顯促進(jìn)凝乳酶活力，其中以Mn2+、Mg2+、Ca2+的促進(jìn)作用最顯著，Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+對(duì)酶活力有抑制作用，其中以Co2+、Ni2+的抑制作用最顯著，而Na+、K+、Li+對(duì)凝乳酶的活力幾乎無(wú)作用。乙醇、SDS溶液對(duì)凝乳酶活力有抑制作用，且均隨著濃度增加，抑制作用隨之增強(qiáng)。而β-巰基乙醇對(duì)凝乳酶活力有明顯促進(jìn)作用。上述研究表明，該凝乳酶可作為傳統(tǒng)凝乳酶的替代酶，根據(jù)該凝乳酶的酶學(xué)特性制作干酪具有廣闊的發(fā)展前景。