趙福江，王云亭

（中日友好醫(yī)院 骨科，北京 100029）

組織工程骨修復(fù)骨不連研究進(jìn)展

趙福江，王云亭?

（中日友好醫(yī)院 骨科，北京 100029）

骨不連是骨折常見并發(fā)癥。美國(guó)每年發(fā)生的約600萬骨折患者中，約5%～10%發(fā)生骨不連[1]。骨不連的治療措施多種多樣，自體骨移植是目前臨床上治療骨不連的主要方法。但該方法存在一些缺陷，并可帶來一些并發(fā)癥，不利于其在臨床上的廣泛使用[2]。用組織工程骨替代自體骨移植來促進(jìn)骨生成是近年來研究的熱點(diǎn)。現(xiàn)就組織工程骨修復(fù)骨不連的研究進(jìn)展情況做一綜述如下。

1 骨不連

1.1 骨不連概述

骨不連是指骨折后未形成骨連接，骨愈合過程停止。對(duì)于診斷骨不連的確切時(shí)間沒有明確的定義，美國(guó)食品與藥品管理局（FDA）將其定義為9個(gè)月[3]。根據(jù)X線表現(xiàn)，骨不連可以分為萎縮型和肥大型骨不連兩種類型。肥大型骨不連骨折端有充分的血供[4]，萎縮型骨不連主要是由于骨折端血運(yùn)缺乏所致，成骨能力下降[5]。

1.2 骨不連的病因

引起骨不連的原因很多，主要包括全身因素和局部因素。全身因素包括營(yíng)養(yǎng)不良，糖尿病，吸煙，骨質(zhì)疏松以及非甾體類抗炎藥的使用；局部因素包括局部感染，血運(yùn)缺乏，骨折端固定不牢固，骨折端接觸不充分以及高能量損傷等[6]。影響骨折愈合的根本因素在于骨折局部的血液供應(yīng)。Reed等[7，8]研究發(fā)現(xiàn)萎縮型骨不連患者和肥大型骨不連患者骨折處的血管計(jì)數(shù)基本相同，并通過動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)萎縮型骨不連骨折處血運(yùn)在早期明顯減少，3周時(shí)開始增多，到第8周時(shí)和肥大型骨不連處血管計(jì)數(shù)基本相同。因此，Reed認(rèn)為血運(yùn)不足是引起骨不連的主要原因。后期雖然血運(yùn)恢復(fù)，但骨愈合過程已停止，骨不連繼續(xù)存在[7]。

1.3 骨不連目前的治療方法及存在的缺陷

骨不連目前主要的治療主要包括牢固的固定和自體骨移植。自體骨移植包括了骨修復(fù)所有的核心因素：（1）骨引導(dǎo)作用的三維支架；（2）骨誘導(dǎo)作用的生長(zhǎng)因子；（3）成骨作用的細(xì)胞[9]。自體骨移植治療骨不連治愈率較高，但是在取得良好效果的同時(shí)也伴隨著一些不利因素，限制了骨移植治療的廣泛使用[2]。自體骨移植來源有限，尤其是在伴有較大的骨缺損或者缺損形態(tài)不規(guī)則的時(shí)候，自體骨移植很難提供充足及合適的骨。而且自體骨移植還可能帶來很多并發(fā)癥：自體骨移植需行手術(shù)從患者體內(nèi)取骨，對(duì)患者造較大的創(chuàng)傷；還可能造成傷口感染，術(shù)后供骨區(qū)持續(xù)疼痛及傷口處血腫等，給患者帶來很大痛苦。這些不利因素都不利于自體骨移植的廣泛使用。同種異體骨來源也有限，且有傳播肝炎和艾滋病等傳染病的危險(xiǎn)，而且牽涉?zhèn)惱韱栴}。異種骨移植雖然來源廣泛，但免疫排斥反應(yīng)嚴(yán)重，成骨能力較差[10]。為了克服骨移植在治療骨不連中的缺陷，很多專家學(xué)者開始尋找骨移植的替代治療。

2 骨組織工程在治療骨不連中的作用

2.1 骨組織工程概述

骨組織工程是將患者或供者的特定細(xì)胞（干細(xì)胞、祖細(xì)胞）在體外支架材料上生長(zhǎng)，形成一個(gè)三維結(jié)構(gòu)，然后移植到患者體內(nèi)[11]。移植后，細(xì)胞分化并轉(zhuǎn)移到支架內(nèi)部，血管附上并蔓延到新組織內(nèi)部，然后生成骨組織。骨組織工程的最終目的是將支架材料在體內(nèi)誘導(dǎo)成骨樣結(jié)構(gòu)，從而取代缺損或病變的骨組織[11]。

2.2 血管化在骨組織工程中的作用

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，要求各種細(xì)胞的活化、遷移、分化成熟，合成細(xì)胞外基質(zhì)和各種形態(tài)結(jié)構(gòu)[12]。因此血管生成過程是早期創(chuàng)傷和骨折愈合過程中的關(guān)鍵因素，并且是充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，以及引導(dǎo)炎性細(xì)胞到達(dá)創(chuàng)傷部位最重要的因素[4]。移植后生物材料成功引導(dǎo)骨生成依賴于能發(fā)揮生物活性的細(xì)胞[13]。該過程中，骨細(xì)胞長(zhǎng)入支架內(nèi)部及生物材料內(nèi)部血管生成必須同時(shí)發(fā)生。血管的生長(zhǎng)范圍決定新生骨生成情況。骨的生長(zhǎng)需要血管網(wǎng)絡(luò)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，帶走代謝產(chǎn)物。但礦化骨不能通過滲透和擴(kuò)散作用提供營(yíng)養(yǎng)，血管只能在100μm以內(nèi)提供營(yíng)養(yǎng)，100μm外的各種細(xì)胞因得不到充足營(yíng)養(yǎng)不能存活[14]。因此，在組織工程骨治療骨不連過程中，提高組織工程骨的血管化水平成為移植成功的關(guān)鍵。

2.3 種子細(xì)胞

隨著干細(xì)胞與組織工程技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)骨組織工程的認(rèn)識(shí)更加深入。許多文獻(xiàn)報(bào)道成功的骨移植材料需要提供骨折愈合的三個(gè)核心要素：骨引導(dǎo)作用的支架材料，骨誘導(dǎo)作用的生長(zhǎng)因子以及成骨細(xì)胞[13]。而骨引導(dǎo)與骨誘導(dǎo)作用的發(fā)揮依賴于成骨細(xì)胞的作用[9]。對(duì)種子細(xì)胞的研究也從單純間充質(zhì)細(xì)胞過渡到成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。

2.3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）

MSCs是存在于骨髓中非造血干細(xì)胞的另一種干細(xì)胞，是由中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞，具有多向分化潛能，不僅能分化為造血實(shí)質(zhì)支持造血，還可以分化為多種造血以外的組織細(xì)胞，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細(xì)胞，如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等[16]。目前已有研究表明MSCs可以分化為成骨細(xì)胞，并已通過特定的條件在體外成功誘導(dǎo)分化出成骨細(xì)胞[17]。骨折的愈合主要包括膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨兩個(gè)過程。膜內(nèi)成骨是MSCs增殖分化為成骨細(xì)胞，由成骨細(xì)胞生成骨組織；軟骨內(nèi)成骨是MSCs分化為軟骨細(xì)胞，形成軟骨，再通過一系列重塑過程形成骨組織。因此，MSCs是具有成骨潛力的細(xì)胞，骨愈合過程離不開MSCs的參與[12]。在當(dāng)前的骨組織學(xué)研究中，大量學(xué)者使用MSCs做為種子細(xì)胞與支架材料結(jié)合研究骨生成情況。有學(xué)者將載有MSCs的三維支架移植到經(jīng)免疫抑制的小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)有新骨組織生成[18]。

將MSCs作為種子細(xì)胞的組織工程骨用于治療骨不連，無法解決三維支架內(nèi)部血運(yùn)缺乏的問題。由于三維支架內(nèi)血管缺乏，將負(fù)載MSCs的三維支架材料移植到動(dòng)物體內(nèi)后，大量MSCs因無法獲得足夠的氧氣與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而壞死[19]，數(shù)量減少。此外，MSCs需轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞才能發(fā)揮成骨作用，而人體內(nèi)MSCs數(shù)量有限，且只有很小一部分能轉(zhuǎn)化為成骨系細(xì)胞發(fā)揮成骨作用[20]。鑒于以上不足，一些學(xué)者開始考慮使用具有直接成骨作用的成骨細(xì)胞及有成血管作用的內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合來治療骨不連[19，21]。

2.3.2 成骨細(xì)胞

在骨折愈合及骨骼發(fā)育過程中，新骨的生成是一個(gè)復(fù)雜、多階段的過程，包括一系列的生物反應(yīng)。在第一階段，成骨細(xì)胞或其祖細(xì)胞從周圍的組織及血液循環(huán)中募集到將要發(fā)生骨生成的部位[22]。到達(dá)特定部位后，細(xì)胞增殖分化為成熟的功能成骨細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，形成骨。因此，成骨細(xì)胞或其祖細(xì)胞聚集到骨折部位是新骨生成的基礎(chǔ)[23]。骨不連，尤其是萎縮型骨不連患者，由于缺乏血供，成骨細(xì)胞及其祖細(xì)胞無法正常到達(dá)骨折部位，使正常骨折愈合過程無法繼續(xù)進(jìn)行。如果將成骨細(xì)胞作為組織工程的種子細(xì)胞，移植到骨不連處，成骨細(xì)胞即可在原位分泌細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)骨不連愈合。使用成骨細(xì)胞避免了從MSCs分化為成骨細(xì)胞的過程，從而縮短了骨愈合的時(shí)間，并可保證成骨細(xì)胞的數(shù)量。當(dāng)前體外誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞的技術(shù)已經(jīng)比較成熟，已有很多學(xué)者將骨髓間充質(zhì)細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞[17]。

2.3.3 內(nèi)皮細(xì)胞

骨組織成功移植需要許多復(fù)雜的過程。首先發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，隨后的修復(fù)過程導(dǎo)致骨折愈合。在這個(gè)過程中，骨細(xì)胞和血管必須同時(shí)長(zhǎng)入支架材料。內(nèi)皮細(xì)胞是這些過程中主要的細(xì)胞。它參加炎性反應(yīng)過程，并通過分泌炎性因子和表達(dá)細(xì)胞粘附分子參與骨修復(fù)過程[24]。除此之外，內(nèi)皮細(xì)胞還構(gòu)成了血管的內(nèi)壁[21]。內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成刺激物，比如1型膠原、VEGF、和bFGF的作用下，在體外可以生成管腔樣結(jié)構(gòu)[24]。內(nèi)皮細(xì)胞可以從人臍靜脈中得到，并通過體外培養(yǎng)得到擴(kuò)充。但通過這種途徑獲得內(nèi)皮細(xì)胞來源有限。現(xiàn)在，人們發(fā)現(xiàn)MSCs具有分化成內(nèi)皮細(xì)胞的潛能。MSCs來源廣泛，已有學(xué)者通過在體外利用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、纖維素樣生長(zhǎng)因子-B（fibroblast growth factor-B，b-FGF）成功將MSCs誘導(dǎo)成內(nèi)皮細(xì)胞[25]。

2.3.4 內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞聯(lián)合作為種子細(xì)胞

由于上述內(nèi)皮細(xì)胞的成血管作用和成骨細(xì)胞的成骨作用，將兩者聯(lián)合作為種子細(xì)胞有望成為治療骨不連一種新的方法[14]。包含內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞的三維支架，在植入體內(nèi)前經(jīng)過一段時(shí)間的體外誘導(dǎo)，生成血管[21]。植入體內(nèi)后，這些血管就可發(fā)揮功能，帶來氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使成骨細(xì)胞充分發(fā)揮成骨作用，從而有利于骨折愈合，克服了將成骨細(xì)胞單獨(dú)作為種子細(xì)胞的缺陷。另外，這兩種細(xì)胞除了各自的成骨和成血管作用以外，還具有相互促進(jìn)的作用[26～29]。

研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌一些細(xì)胞因子影響成骨細(xì)胞的功能和分化，而成骨細(xì)胞除表達(dá)這些細(xì)胞因子的受體外還可以分泌細(xì)胞因子影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能[26]。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌骨形態(tài)蛋白 （bone morphogenic proteins，BMPs）及內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）等細(xì)胞生長(zhǎng)因子[27]。BMP是作用最強(qiáng)的骨誘導(dǎo)蛋白：BMP能促進(jìn)成骨細(xì)胞的趨化作用，BMP-2能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞[28，29]。ET-1能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖和分化，并能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的表達(dá)和?型膠原的生成[25]。內(nèi)皮細(xì)胞通過這兩種作用提高成骨細(xì)胞的成骨能力。除此之外，成骨細(xì)胞可以分泌VEGF[30]。VEGF能夠促進(jìn)MSCs誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞，并使內(nèi)皮細(xì)胞生成血管[25]。Unger等[21]將內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞在體外聯(lián)合培養(yǎng)，在不加任何生長(zhǎng)因子的情況下見到管腔樣結(jié)構(gòu)和骨樣組織生成。而將兩者單獨(dú)培養(yǎng)，則基本上沒有管腔結(jié)構(gòu)，且僅有少量骨組織生成。張建等[31]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞聯(lián)合作為種子細(xì)胞修復(fù)下頜骨缺損時(shí)，無論是促進(jìn)骨生成還是促進(jìn)血管生成的效果都要明顯高于單純成骨細(xì)胞。

3 組織工程骨治療骨不連的現(xiàn)狀及展望

目前，組織工程骨的研究以及在臨床上的使用已經(jīng)取得了一定的成果。Kruyt等[32]使用BMSCs做為種子細(xì)胞植入山羊的脊柱間發(fā)現(xiàn)了明顯的成骨反應(yīng)；Kitoh等[17]在施行3例骨延長(zhǎng)手術(shù)時(shí)，將BMSCs配合富含血小板的血漿注入牽拉成骨的部位，發(fā)現(xiàn)可以明顯提高成骨的速度；Yu等[14]將MSCs誘導(dǎo)為血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞，然后將兩種細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，得到血管化的組織工程骨，植入動(dòng)物體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)其成骨作用較單純使用成骨細(xì)胞有明顯提高。Gan等[15]利用患者自體骨髓細(xì)胞進(jìn)行離心濃縮后，將得到的MSCs與β-三磷酸鈣混合后用用于脊柱融合，取得了較好的效果。楊志明等[33]應(yīng)用自體BMSCs對(duì)52例患者多個(gè)部位的骨缺損、骨不愈合進(jìn)行修復(fù)，初步證實(shí)：①組織工程骨具有良好的成骨能力和修復(fù)效果；②采用同種異體來源的成骨細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)明顯組織排斥反應(yīng)及其他并發(fā)癥。

但是，目前組織工程骨的應(yīng)用還存在一些問題：種子細(xì)胞往往需要體外培養(yǎng)或誘導(dǎo)達(dá)到一定的數(shù)量后，才能在體內(nèi)發(fā)揮最大的作用，而體外環(huán)境無法完全模擬體內(nèi)環(huán)境，因此，種子細(xì)胞的安全性問題需要我們更進(jìn)一步的研究[34]。此外，進(jìn)行不同類型組織工程骨構(gòu)建研究，以及具有活力的血管化組織工程骨的構(gòu)建，是組織工程臨床應(yīng)用所必須解決的關(guān)鍵技術(shù)問題[35]。

骨組織工程的臨床應(yīng)用尚處于起步階段，距離廣泛的臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。隨著組織工程越來越受到廣大學(xué)者的關(guān)注，相信不久的將來，組織工程在基礎(chǔ)研究及臨床使用上將會(huì)取得突破性的成果。

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R68

A

1001-0025（2010）01-0051-03

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衛(wèi)生部臨床學(xué)科重點(diǎn)項(xiàng)目[2007]353號(hào)；國(guó)家自然科學(xué)基金（30772194，30672117）。

*本文通訊作者。

趙福江（1981-），男，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。

2009-08-04

2009-12-29