趙潞，張列兵，張世湘，郝彥玲

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

利用種特異性PCR快速鑒定新疆酸馬奶優(yōu)勢菌群

趙潞，張列兵，張世湘，郝彥玲

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

建立了一種快速準(zhǔn)確鑒定酸馬奶中乳酸菌優(yōu)勢菌群的種特異性PCR技術(shù)。據(jù)資料報道，酸馬奶中已知的6種優(yōu)勢菌主要集中在植物乳桿菌、干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌3大類群。首先，針對屬于同一類群內(nèi)的兩種優(yōu)勢菌設(shè)計2對種特異性引物，采用3組PCR實驗驗證引物的特異性。然后以酸馬奶中提取的總DNA為模板，利用經(jīng)驗證的6對種特異性引物鑒定2份新疆酸馬奶樣品中的優(yōu)勢菌群。結(jié)果表明，新疆酸馬奶中含有Lactobacillus（L.）helveticus，L.pentosus，L.plantarum，L.acidophilus和L.paracasei，與前人報道結(jié)果一致。 本研究建立的種特異性PCR技術(shù)不僅能夠快速鑒定酸馬奶中乳酸菌優(yōu)勢菌群組成，同時可為其它發(fā)酵制品中3大類群乳酸菌鑒定提供有效的方法。

種特異性PCR；酸馬奶；乳酸菌；優(yōu)勢菌群

0 引 言

酸馬奶是以鮮馬奶為原料，經(jīng)乳酸菌和酵母菌等微生物共同發(fā)酵而成的乳飲料，主要飲用于新疆和內(nèi)蒙古等地?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實，酸馬奶具有降血壓、降血脂和調(diào)節(jié)胃腸道等功能[1]。其中，優(yōu)勢乳酸菌菌群在其醫(yī)療保健功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，酸馬奶中乳酸菌多樣性成為目前研究熱點[2，3]。

目前，乳制品中乳酸菌多樣性研究可分為依賴培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法和非培養(yǎng)的分子方法。依賴培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法僅對可培養(yǎng)的活菌進(jìn)行分離，而且純化及生理生化鑒定費時費力，且結(jié)果易與樣品本身乳酸菌多樣性存在偏差[4]。與之相比，作為非培養(yǎng)方法的種特異性PCR技術(shù)不僅快速準(zhǔn)確，而且容易普及。

據(jù)資料報道，酸馬奶中優(yōu)勢菌主要集中在16S rRNA序列無法鑒定的植物乳桿菌，干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌類群[5,6]。因此，為了準(zhǔn)確區(qū)分每個類群中乳酸菌，本研究設(shè)計6對種特異性引物，以酸馬奶中提取總DNA為模板，建立了一種快速鑒定酸馬奶優(yōu)勢菌群的種特異性PCR方法。

1 實 驗

1.1 材料

（1） 菌 株 來 源 ：L.plantarum 05-19,L.paracasei E4213，L.helveticus AS1.1877T,L.acidophilus La3。L.casei.subsp.casei ATCC393，L.pentosus ATCC8041。

（2）酸馬奶樣品：實驗所檢測的兩份酸馬奶樣品均采自新疆伊犁地區(qū)新源縣那拉提夏牧場的哈薩克牧民家庭。

（3）試劑和儀器：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒以及PCR相關(guān)試劑。PCR儀（PTC-200型）。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌基因組DNA提取

將乳酸菌以質(zhì)量濃度為10 g/L接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)OD600至0.6～0.8，離心收集菌體，按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行提取，采用質(zhì)量濃度為10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.2 酸馬奶樣品細(xì)菌總DNA提取

酸馬奶樣品總DNA提取參照Baradei等[7]方法，并進(jìn)行改進(jìn)。5 mL酸馬奶樣品與5 mL質(zhì)量濃度為20 g/L檸檬酸鈉溶液振蕩混勻后，加10 mg鏈霉蛋白酶和20 μL β-巰基乙醇，50℃水浴3 h。菌體經(jīng)洗滌后，利用溶菌酶結(jié)合SDS變性劑裂解菌體，采用酚仿和異丙醇分離純化總DNA，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 種特異性PCR引物及擴(kuò)增條件

本實驗采用的6種乳酸菌種特異性PCR引物及擴(kuò)增條件如表1所示。

1.2.4 PCR驗證及優(yōu)勢菌群的鑒定

表1 種特異性PCR引物及擴(kuò)增條件

為了考察每一類群中文獻(xiàn)推薦引物的特異性，設(shè)置3組種特異性引物的PCR實驗進(jìn)行驗證。首先以目標(biāo)菌種基因組為模板（陽性對照）和屬于同一類群的菌種基因組為模板（陰性對照）兩組PCR驗證引物特異性。其次，以同一種群內(nèi)的兩菌種的混合基因組為模板進(jìn)行PCR（各0.5 ng），驗證在同類群菌的干擾下，引物的種特異性。最后，以酸馬奶樣品總DNA為模板，分別采用植物乳桿菌類群、干酪乳桿菌類群和嗜酸乳桿菌類群的6對特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，利用質(zhì)量濃度為20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測酸馬奶中優(yōu)勢菌群的組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 種特異性引物的PCR驗證

2.1.1 植物乳桿菌類群的種特異性PCR驗證

為了驗證植物乳桿菌類群中引物的特異性。首先以植物乳桿菌為陰性對照，以戊糖乳桿菌基因組和混合基因組為陽性對照，3組PCR驗證戊糖乳桿菌的引物特異性，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，陽性對照泳道2和4出現(xiàn)與預(yù)期片段218 bp一致的條帶，而陰性對照未出現(xiàn)相應(yīng)條帶；其次以戊糖乳桿菌基因組為陰性對照，以植物乳桿菌基因組和混合基因組為陽性對照，3組PCR驗證植物乳桿菌的引物特異性，從圖1可見，陽性對照泳道6和8出現(xiàn)與預(yù)期片段318 bp一致的條帶，而陰性對照未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。結(jié)果表明，所用兩對引物能很好的區(qū)分同屬于植物乳桿菌類群內(nèi)的植物乳桿菌和戊糖乳桿菌。

圖1 植物乳桿菌類群特異性檢測結(jié)果

圖1中，M為DL2000 Marker（下同）；1～4為戊糖乳桿菌特異性PCR；模板分別：1為ddH2O；2為戊糖乳桿菌基因組；3為植物乳桿菌基因組；4為植物乳桿菌和戊糖乳桿菌混合基因組；5～8為植物乳桿菌特異性PCR；5為ddH2O；6為植物乳桿菌基因組；7為戊糖乳桿菌基因組；8為植物乳桿菌和戊糖乳桿菌混合基因組。

2.1.2 干酪乳桿菌類群的特異性驗證

為了驗證干酪乳桿菌類群中引物的特異性，實驗設(shè)計思路如2.1.1所述。從圖2可見，陽性對照泳道2和4、6和8分別出現(xiàn)與干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌預(yù)期大小一致的條帶，均為290 bp，而陰性對照均未出現(xiàn)相應(yīng)條帶，實驗結(jié)果說明所用的兩對引物能很好的區(qū)分同屬干酪乳桿菌類群中的干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌。

圖2 干酪乳桿菌類群特異性檢測結(jié)果

圖2中，1～4為干酪乳桿菌特異性PCR；模板分別：1為ddH2O；2為干酪乳桿菌基因組；3為副干酪乳桿菌基因組；4為干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌混合基因組；5～8為副干酪乳桿菌特異性PCR；模板分別：5為ddH2O；6為副干酪乳桿菌基因組；7為干酪乳桿菌基因組；8為副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌混合基因組。

2.1.3 嗜酸乳桿菌類群特異性驗證

為了驗證嗜酸乳桿菌類群中引物的特異性，實驗設(shè)計思路如2.1.1所述。圖3為干酪乳桿菌類群特異性檢測結(jié)果。由圖3可以看出，陽性對照泳道2，4，6和8分別出現(xiàn)與瑞士乳桿菌和嗜酸乳桿菌預(yù)期大小一致的條帶，分別為524 bp和740 bp，而陰性對照均未出現(xiàn)相應(yīng)條帶，實驗結(jié)果說明所用的兩對引物能很好的區(qū)分同屬嗜酸乳桿菌類群中的嗜酸乳桿菌和瑞士乳桿菌。

圖3 干酪乳桿菌類群特異性檢測結(jié)果

圖3中，1～4為 瑞 士 乳 桿 菌 特 異 性PCR；1為ddH2O；2為瑞士乳桿菌基因組；3為嗜酸乳桿菌基因組；4為瑞士乳桿菌和嗜酸乳桿菌混合基因組；5～8為嗜酸乳桿菌特異性PCR；5為ddH2O；6為 嗜酸乳桿菌基因組；7為瑞士乳桿菌基因組；8為瑞士乳桿菌和嗜酸乳桿菌混合基因組。

2.1.4 利用PCR方法鑒定酸馬奶中的優(yōu)勢乳酸菌

以2份酸馬奶總DNA為模板，進(jìn)行3大類群的特異性PCR擴(kuò)增。圖4為種特異性PCR方法鑒定1號酸馬奶樣品中優(yōu)勢乳酸菌。由圖4可以看出，1號樣品中含有L.pentosus，L.plantarum，L.helveticus和L.acidophilus。 圖5為種特異性PCR方法鑒定2號酸馬奶樣品中優(yōu)勢乳酸菌。由圖5可以看出，2號樣品中含有L.pentosus，L.helveticus，L.paracasei。 孫天松等[2-3,5]用傳統(tǒng)分離鑒定方法對酸馬奶中的乳酸菌組成進(jìn)行研究，結(jié)果表明優(yōu)勢菌主要有L.acidophilus，L.plantarum，L.pentosus，L.casei和L.helveticus，這與本研究結(jié)果一致。因此，本研究建立的種特異性PCR技術(shù)不僅能夠快速鑒定酸馬奶中乳酸菌優(yōu)勢菌群組成，同時可為其他發(fā)酵制品中3大類群乳酸菌的鑒定提供行之有效的方法。

圖4 PCR方法鑒定1號酸馬奶樣品中優(yōu)勢乳酸菌

圖5 PCR方法鑒定2號酸馬奶樣品中優(yōu)勢乳酸菌

圖4中，特異性引物分別：1為戊糖乳桿菌；2為植物乳桿菌；3為干酪乳桿菌；4為副干酪乳桿菌；5為瑞士乳桿菌；6為嗜酸乳桿菌。圖5中，特異性引物分別：1為戊糖乳桿菌；2為植物乳桿菌；3為干酪乳桿菌；4為副干酪乳桿菌；5為瑞士乳桿菌；6為嗜酸乳桿菌。

3 結(jié)果與討論

目前，酸馬奶中乳酸菌生物多樣性的研究皆采用依賴培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法，資料報道酸馬奶中乳酸菌的6種優(yōu)勢菌分別屬于乳酸菌的3個類群，其中，L.acidophilus和L.helveticus屬于嗜酸乳桿菌類群，L.plantarum和L.pentosus屬于植物乳桿菌類群，L.casei和L.paracasei屬于干酪乳桿菌類群[12]。由于三大類群內(nèi)菌種之間的生理生化特性和16S rRNA基因序列都高度相似，因此無法精確鑒定類群內(nèi)菌種[10]。

種特異性PCR技術(shù)是根據(jù)每物種rDNA上可變區(qū)或編碼基因的特有序列設(shè)計引物，進(jìn)行物種鑒定的方法，此方法的關(guān)鍵是引物的選取。本研究建立的種特異性PCR方法可用于鑒定培養(yǎng)方法分離的3大類群中的菌株，是對傳統(tǒng)乳酸菌鑒定方法的一個重要補(bǔ)充。此外，與依賴培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法相比，原來需要幾周完成的菌種鑒定工作，種特異PCR技術(shù)在12 h內(nèi)即可結(jié)束，是一種簡單，快速的檢測手段。

變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)是一種不依賴于培養(yǎng)過程而對樣品中微生物組成直接進(jìn)行鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)，其理論依據(jù)為片段大小相同、堿基組成不同的雙鏈DNA分子，在變性凝膠梯度電泳時因具有不同的解鏈溫度而滯留于凝膠的不同位置，最終形成相互分開的譜帶[13]。目前，DGGE技術(shù)常用的靶基因是16S rRNA V3區(qū)。但由于3大類群內(nèi)菌株V3區(qū)序列高度相似，DGGE時會發(fā)生共遷移現(xiàn)象，導(dǎo)致無法根據(jù)Marker比對和測序的方法鑒定菌種，需要通過種特異性PCR方法進(jìn)一步鑒定[4]。因此，本研究建立的種特異性PCR方法也是DGGE技術(shù)鑒定共遷移菌種的一個重要環(huán)節(jié)。

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Rapid identification of the dominant LAB in fermented Koumiss produced in Xinjiang using species-specific PCR

ZHAO Lu,ZHANG Lie-bing,ZHANG Shi-xiang,HAO Yan-ling
（College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing100083,China）

In order to identify the dominant lactic acid bacteria（LAB）in koumiss rapidly and precisely,a species-specific PCR method was established.It was reported that six dominant LAB species existed in koumiss,which belong to L.plantarum group,L.casei group and L.acidophilus group.First,two pairs of species-specific primers were designed to distinguish the dominant strains belonging to the same group,and their specificity was respectively determined by three PCR tests.Then,the total DNA extracted from samples was used as template,and the dominant LAB of two koumiss products from Xinjiang were identified by the six pairs of species-specific primers.The results showed that L.helveticus,L.pentosus,L.plantarum,L.acidophilus and L.paracasei were presented,which was consisted with previously reports.In addition to analyze the dominant LAB in koumiss rapidly,this species-specific PCR method also can identify the LAB belonging to the three groups in other fermented products.

species-specific PCR；Koumiss；LAB；dominant bacteria

Q93-331

A

1001-2230（2010）01-0012-03

2009-07-16

國家自然科學(xué)基金項目（30671483），國家高技術(shù)研究與發(fā)展計劃（863計劃）項目（2007AA10Z354,2006AA10Z317）。

趙潞 （1985-），男，碩士研究生，研究方向為乳品微生物。

郝彥玲