喻春皓　張海江　張　萍

摘 要:在中醫(yī)藥理論和現(xiàn)代人體生命科學(xué)理論的基礎(chǔ)上,從中藥成分代謝研究中探析,結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)等現(xiàn)代學(xué)科理念,運用先進的分析檢測技術(shù)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù),尤其是體外生物轉(zhuǎn)化技術(shù),可改善中藥制劑的療效與個體差異,提出新的中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)工程——中草藥生物轉(zhuǎn)化工程,以及相應(yīng)的創(chuàng)新中藥——生物中藥。重點探討了微生物轉(zhuǎn)化與酶法轉(zhuǎn)化技術(shù)在創(chuàng)新中藥研發(fā)體系中的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞:中草藥生物轉(zhuǎn)化工程;微生物工程;酶工程;生物中藥

中圖分類號:R932文獻標(biāo)識碼:A文章編號:1673-2197(2009)06-0001-04

隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化戰(zhàn)略的逐步推行,中醫(yī)藥發(fā)展正迎來新的挑戰(zhàn)與機遇。中國科學(xué)院院士王夔在為《中藥成分代謝分析》作序時指出:“近年來中藥現(xiàn)代化研究基本上是以產(chǎn)品為目標(biāo),以新中藥制劑開發(fā)為目的。開發(fā)有余,而研究不足。實際上,中藥現(xiàn)代化的根本是中藥學(xué)現(xiàn)代化。中藥產(chǎn)品的現(xiàn)代化可以栽培現(xiàn)代化、質(zhì)檢和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)代化、工藝現(xiàn)代化等等方面下功夫,執(zhí)行GAP、GLP、GEP、GMP、GCP等標(biāo)準(zhǔn)。但是,即使如此開發(fā)的中成藥仍然在世界藥學(xué)中不能占有舉足輕重的地位;接受這些產(chǎn)品的絕大多數(shù)是華人。我們必須強調(diào)中藥的現(xiàn)代化要以中藥學(xué)現(xiàn)代化為基礎(chǔ);也就是中藥學(xué)要用世界自然科學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)能夠接受的概念和理論來闡述?！盵1]要中醫(yī)藥現(xiàn)代化,首先是中醫(yī)藥理論的現(xiàn)代化,再是中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化。筆者認為,在探索中國古典哲學(xué)、中醫(yī)藥理論、現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與現(xiàn)代科學(xué)方法論、現(xiàn)代人體生命科學(xué)理論等相互結(jié)合的基礎(chǔ)上,推動中醫(yī)理論的科學(xué)化、現(xiàn)代化,并在現(xiàn)代中醫(yī)理論的指導(dǎo)下進行中藥現(xiàn)代化研究及其創(chuàng)新的研發(fā)[2]。

在總結(jié)古今傳統(tǒng)中藥和方劑中涉及生物轉(zhuǎn)化原理的基礎(chǔ)上,從中藥成分代謝分析中探析,結(jié)合化學(xué)成分組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、糖生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、藥物設(shè)計學(xué)、高通量篩選技術(shù)等現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù),運用生物轉(zhuǎn)化技術(shù),尤其是運用體外生物轉(zhuǎn)化技術(shù)改善中藥制劑的療效與個體差異,提出了新的中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)工程——中草藥生物轉(zhuǎn)化工程,以及相應(yīng)的創(chuàng)新中藥——生物中藥。中草藥生物轉(zhuǎn)化工程是將酶工程、微生物工程、代謝工程、基因工程、糖生物工程、藥物設(shè)計工程、生物信息學(xué)等現(xiàn)代生物工程技術(shù)合理運用到中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中,合理繼承傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論,對中醫(yī)藥進行創(chuàng)新與傳承,并開發(fā)出相應(yīng)的生物中藥。中草藥生物轉(zhuǎn)化工程的兩個主要研究內(nèi)容:微生物轉(zhuǎn)化與創(chuàng)新中藥、酶法轉(zhuǎn)化與創(chuàng)新中藥。

1 微生物轉(zhuǎn)化與創(chuàng)新中藥

1.1 微生物發(fā)酵與傳統(tǒng)中藥

在研究中華醫(yī)藥史中著名中草藥及方劑的過程中發(fā)現(xiàn),利用微生物技術(shù)制備傳統(tǒng)中藥有著悠久的歷史。“酒為百藥之長”,具有通血脈、行藥勢等功效,原始的釀酒技術(shù)產(chǎn)生于4000多年前的夏禹時代,酒是酵母發(fā)酵的產(chǎn)物,是細胞內(nèi)酶作用的結(jié)果[3]。約3000年前,利用麥曲含有的淀粉酶將淀粉降解為麥芽糖,制得具有緩中、補虛、生津、潤燥功效的飴糖。在長沙馬王堆漢墓出土的帛書《五十二病方》中記載了用于治病的糞便類中藥,實際上是宿主與其消化道內(nèi)的厭氧微生物共同代謝與發(fā)酵產(chǎn)生的混合物。公元10世紀(jì)左右,我國有了豆醬制品,及由此工藝衍化制備出的用于解肌發(fā)表和宣郁除煩的淡豆豉,豆醬和淡豆豉均是微生物的發(fā)酵產(chǎn)物。三國時期的著名醫(yī)學(xué)家華佗創(chuàng)造了制備金汁的秘法,即利用刮青竹筒(天然膜管)從糞窖內(nèi)人源性微生物與自然界微生物混合深層發(fā)酵產(chǎn)物中提取而得[4]。首載于元代《飲膳正要》中的紅曲,為微生物紅曲霉發(fā)酵梗米加工品而產(chǎn)生的發(fā)酵物,具有健脾消食、活血化瘀等功效[5]。我國是最早利用真菌防病治病的國家,早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中,就有靈芝、茯苓、豬苓、雷丸等藥用真菌的記載[6],現(xiàn)仍廣泛應(yīng)用。真菌具有分解纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、脂類等營養(yǎng)物質(zhì)的強大酶系,對天然培養(yǎng)基有較強的分解利用能力,具有種類多、次生代謝產(chǎn)物多、培養(yǎng)條件簡單等特點,成為微生物發(fā)酵炮制或制備傳統(tǒng)中藥的主要功能菌。利用古老中藥中寄生真菌自身發(fā)酵的研究已成為現(xiàn)在研究的熱點,如靈芝、冬蟲夏草、云芝、灰樹花、茯苓、麥角菌等都有大量的研究報道[6]。

微生物發(fā)酵是傳統(tǒng)中藥中的一種重要炮制方法。我國人民將微生物發(fā)酵應(yīng)用于中藥炮制,即將藥材與輔料拌和,在一定溫度和濕度下,通過微生物的生物轉(zhuǎn)化作用達到提高藥效、改變藥性、降低毒副作用等目的[6]?！吨腥A人民共和國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》中收錄的19種曲藥,如,配方和工藝均絕密的片仔癀、六神曲、建曲、采云曲、霞天曲、黔曲、半夏曲、老范志萬應(yīng)曲、泉州百草曲、沉香曲等,均是微生物固態(tài)發(fā)酵而成的中藥。不同培養(yǎng)基經(jīng)同樣微生物處理后會產(chǎn)生不同的藥性,可利用該特性生產(chǎn)具有不同適應(yīng)證的中藥。例如,發(fā)酵淡豆豉時,以桑葉、青蒿發(fā)酵者,藥性偏于寒涼,多用于風(fēng)熱感冒或熱病胸中煩悶之癥;以麻黃、紫蘇發(fā)酵者,藥性偏于辛溫,多用于風(fēng)寒感冒頭痛之癥[7]。

微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物是傳統(tǒng)中藥方劑配伍中的一類重要中藥。除目前仍在方劑配伍中廣泛使用的曲藥外,糞便類中藥作為微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物也被古今許多醫(yī)家用于傳統(tǒng)方劑配伍中,如《五十二病方》、《黃帝內(nèi)經(jīng)》、《中華人民共和國藥品標(biāo)準(zhǔn)?中藥成方制劑》等均有記載[8],最為著名的方劑有失笑散、溫病方劑神犀丹及三石湯等。在利用糞便類中藥配伍方劑治病方面,尤其值得一提的是清朝的著名溫病學(xué)家葉天士,他善于運用金汁配伍于方劑中治病救人,在黃英志主編的《明清名醫(yī)全書大成?葉天士醫(yī)學(xué)全書》中含“金汁”的臨床處方和方劑近100處之多,其中包括著名的溫病靈丹神犀丹。

1.2 微生物轉(zhuǎn)化中藥成分

微生物轉(zhuǎn)化中藥成分的研究始于20世紀(jì)90年代初,日本的小橋恭一發(fā)現(xiàn)中草藥成分如番瀉苷,可借助腸道細菌轉(zhuǎn)化為致瀉有效成分,隨后他的課題組對系列糖苷類化合物如黃芩苷、漢黃芩苷、人參皂苷等進行了研究,指出糖苷類化合物為天然前藥[9]?；驹硎抢梦⑸锛毎a(chǎn)生的一種或多種酶把中藥中的一些化學(xué)成分轉(zhuǎn)化成結(jié)構(gòu)相關(guān)的更有經(jīng)濟價值的產(chǎn)物,來完成常規(guī)化學(xué)方法難以實現(xiàn)的生化反應(yīng),其本質(zhì)是利用微生物本身所產(chǎn)生的酶對外源底物進行的催化反應(yīng),改變藥物原有性能,產(chǎn)生新的功能作用,或增強原有的功能活性。如口服人參皂苷類成分的腸內(nèi)微生物轉(zhuǎn)化[10]。

將微生物工程技術(shù)應(yīng)用于中藥創(chuàng)新,將是中藥創(chuàng)新研發(fā)中的新熱點,其主要特點可概括如下[2]:①藥物的有效組分、活性成分最大限度地得以提取、利用;②藥物進入人體后不能直接被利用的有效活性組分,可在體外生物轉(zhuǎn)化而被直接利用,將高極性中藥成分轉(zhuǎn)化為低極性成分,改善了藥物的脂溶性,使其功效迅速發(fā)揮;③可以提高中藥制劑的普適性,腸道微生態(tài)菌群因個體存在很大的差異性,結(jié)果引起藥物的生物利用和功能作用差異明顯,而通過體外生物轉(zhuǎn)化可避免之,從而提高其普適性;④微生物轉(zhuǎn)化后與原有藥物相比產(chǎn)生了新的活性物質(zhì),從而可能產(chǎn)生新的保健、治療或預(yù)防等功能作用;⑤其具有生產(chǎn)工藝可控、所得產(chǎn)物明確、制劑方便、便于與國際接軌等優(yōu)點,因而是實現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化戰(zhàn)略的有效途徑。

2 酶工程與創(chuàng)新中藥

酶作為生物催化劑,在許多化學(xué)反應(yīng)中具有不可低估的作用,作為生物進化的高級形式,與一般的化學(xué)催化劑相比,它可以在非常溫和的條件下高效、專一性地催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物,具有廣闊的應(yīng)用前景。酶是由細胞產(chǎn)生的具有催化能力的物質(zhì),其化學(xué)本質(zhì)主要為蛋白質(zhì),少數(shù)酶同時含有少量的糖和脂肪,也有少數(shù)是核酸等其它物質(zhì)。酶大部分位于細胞內(nèi),部分分泌到體外。新陳代謝是生命活動的最重要特征,一切生命活動都是由代謝的正常運轉(zhuǎn)來維持的,而生物體代謝中的各種化學(xué)反應(yīng)都是在酶的作用下進行的。酶是促進一切代謝反應(yīng)的物質(zhì),沒有酶,代謝就會停止,生命也即停止。酶工程技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分,其特點是利用生物酶、含酶細胞器或細胞(微生物、植物、動物)作為生物催化劑來完成某些重要的化學(xué)反應(yīng),應(yīng)用范圍包括醫(yī)藥、食品、化學(xué)工業(yè),診斷分析、檢測分析和生物傳感器等。在中藥創(chuàng)新研發(fā)過程中,酶工程技術(shù)將具有舉足輕重的作用。

2.1 酶的分類與中草藥生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型

按照1961年國際生物聯(lián)合會酶學(xué)委員會(Enzyme Commission of International Union Biotechnology)規(guī)定的分類方法,不管酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)如何,僅根據(jù)酶所催化反應(yīng)的類型,將酶分為六大類,即氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、合成酶或連接酶,對應(yīng)為六大中草藥生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型。圖1概述了各類酶的特性與中草藥生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型[1,2,11]。

2.2 酶法轉(zhuǎn)化與中藥

近年來,藥代動力學(xué)研究證明,中藥成分中的糖苷類化合物在腸道內(nèi)難以吸收、生物利用度低、腸內(nèi)滯留時間較長,在人體內(nèi)難以直接發(fā)揮藥效作用,絕大多數(shù)需經(jīng)腸道微生物酶分解為次級苷或苷元,方能發(fā)揮藥效。從糖苷類化合物的結(jié)構(gòu)角度看,含糖基越多,分子極性越高,水溶性就越大,相反水溶性越低,水溶性大的物質(zhì)不易被小腸絨毛吸收,不易穿過腸壁,也就不易進入血液而發(fā)揮藥效,只有被腸道內(nèi)微生物酶水解后才能被吸收而發(fā)揮藥效。因此,腸道內(nèi)微生物酶濃度與酶催化活性直接影響著糖苷類化合物的藥效。研究表明,個體差異性影響腸道內(nèi)微生物酶濃度與催化活性[12,13],患者體溫的升高會影響酶催化活性的發(fā)揮;隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)事業(yè)的發(fā)展,濫用抗生素已經(jīng)嚴重損害人腸道內(nèi)的正常菌群,使腸道菌群失去平衡,不能分泌各種正常酶[14]。這些因素嚴重影響著中藥藥效的發(fā)揮。

如何將中藥材中的糖苷類化合物轉(zhuǎn)化成次級苷或苷元,將成為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中的新熱點,可通過化學(xué)轉(zhuǎn)化、酶轉(zhuǎn)化、微生物轉(zhuǎn)化等方法實現(xiàn)之。化學(xué)轉(zhuǎn)化過程中,因強烈的酸堿水解作用而引起苷類物質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)型的改變,導(dǎo)致藥效消失和產(chǎn)物不穩(wěn)定。因此,酶轉(zhuǎn)化與微生物轉(zhuǎn)化將更具潛力,微生物轉(zhuǎn)化的本質(zhì)仍是酶轉(zhuǎn)化,酶轉(zhuǎn)化是中草藥生物轉(zhuǎn)化工程中的重要內(nèi)容。在酶的催化作用下對中藥中的苷類成分進行系列結(jié)構(gòu)修飾,引起中藥成分的共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,如化學(xué)基團的引入或去除、化學(xué)鍵的引入或斷裂等。修飾后,可引起藥理活性的改變,或中藥制劑(尤其是中藥口服液)風(fēng)味的改善等。

有關(guān)酶法轉(zhuǎn)化中藥的研究開展時間不長,尚處于實驗研究階段。但是,不少學(xué)者已逐步認識到生物轉(zhuǎn)化技術(shù)將是中藥創(chuàng)新研究的重要方法之一。近年來,運用現(xiàn)代生物酶工程技術(shù)開展現(xiàn)代中藥研究,在酶法轉(zhuǎn)化中藥研究領(lǐng)域取得了一些成果。如利用自制復(fù)合酶對生曬參95%乙醇提取物、人參莖葉總皂苷、三七總皂苷、三七莖葉總皂苷等系列中藥有效部位進行了酶法轉(zhuǎn)化研究[2,15],通過HPLC和LC-MS分析發(fā)現(xiàn)可以明顯改變一些皂苷成分的結(jié)構(gòu),并降低相應(yīng)化合物的極性,增加了有效部位中脂溶性含量;同時,利用這些復(fù)合酶直接酶法轉(zhuǎn)化處理人參、三七、三七莖葉等藥材,結(jié)果表明復(fù)合物酶亦能高效地轉(zhuǎn)化藥材中部分皂苷成分為低極性皂苷。這些低極性皂苷具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)消化機能、安神、抗衰老、抗緊張、預(yù)防消化道潰瘍、提高生命質(zhì)量、增強記憶和學(xué)習(xí)能力等多種生物活性和藥效作用,還具有快速吸收、高生物利用度等特點。用酶法輔助提取清熱中藥黃芩活性成分時,HPLC分析發(fā)現(xiàn)提取物中的黃芩素和漢黃芩素等苷元含量遠遠高于藥典的提取方法,表明酶法輔助提取有助于黃芩苷、漢黃芩苷等轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的苷元[16,17]。

3 生物中藥的發(fā)展方向

上文從微生物工程與中藥、酶工程與中藥等兩方面綜述了中草藥生物轉(zhuǎn)化工程的核心內(nèi)容;同時,在中藥儲存、炮制、方劑配伍煎制、體內(nèi)代謝等過程中也涉及到生物轉(zhuǎn)化,囿于篇幅,不再詳述。

中草藥生物轉(zhuǎn)化工程融合了傳統(tǒng)中藥制藥工程、傳統(tǒng)發(fā)酵中藥技術(shù)、現(xiàn)代微生物技術(shù)、酶工程技術(shù)、中藥成分的代謝工程等多種工程技術(shù),其在中藥新藥研究開發(fā)方面具有的獨特優(yōu)勢,可為改善中藥功效、加快中藥制劑的起效速度、提高生物利用度、改善制劑功效的個體差異性、創(chuàng)制新劑型、創(chuàng)制新藥等方面提供嶄新的技術(shù)手段,有望給中藥新藥研究開發(fā)注入新的活力,并將為中藥創(chuàng)新帶來革命性的變革,具有廣闊的發(fā)展前景,預(yù)計不久將成為中藥創(chuàng)新研究中的“紅熱點”。中草藥生物轉(zhuǎn)化工程的發(fā)展方向?qū)⒂绊懮镏兴幍奈磥戆l(fā)展前景,今后應(yīng)在以下幾個方面進行深入研究:①中草藥儲存過程的生物轉(zhuǎn)化及霉變生物轉(zhuǎn)化機制研究;②中草藥炮制過程中的生物轉(zhuǎn)化機制研究;③方劑配伍中的生物轉(zhuǎn)化原理及方劑煎制過程的生物轉(zhuǎn)化研究;④加強微生物和酶工程技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用;⑤加強曲劑制備過程中的生物轉(zhuǎn)化機制研究;⑥加強糞便類中藥的生物轉(zhuǎn)化機制研究;⑦加強生物中藥制藥裝備的研究;⑧利用現(xiàn)代分析技術(shù),建立快速而靈敏的分析檢測技術(shù)手段;⑨建立有效而快速的功效篩選模型;⑩加強中藥成分體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化及功效個體差異性的研究;(11)在生物轉(zhuǎn)化研究過程中如何合理地貫徹中醫(yī)藥理論及現(xiàn)代科學(xué)方法論的指導(dǎo)思想,并吸收利用現(xiàn)代科學(xué)的有益成果。

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(責(zé)任編輯:曾楚華)

Biotransformation Engineering of TCM and the Innovation of TCM

Yu Chunhao, Zhang Haijiang, Zhang Ping

(Huaiyin Institute of Technology, Huai餫n 223003, China)

Abstract:A complete idea of innovative TCM (Traditional Chinese Medicines), TCM-BioTransformation-Engineering (TCMBTE), is presented by studying and exploring Chinese classic philosophy, theories of TCM, prescriptions and methodology of modern science, and scientific theories of modern human-life-sciences, is well-combined biotechnology (enzyme engineering, microbial engineering) with TCM through digesting metabolite analysis of TCM constituents and essence of magically therapeutic effect of famous prescription Shenxidan. It is anticipated that TCMBTE would be a red-hot in the future. In this paper, some key-technologies in TCMBTE are discussed.

Key words:Biotransformation Engineering of TCM;Microbial Engineering;Enzyme Engineering;BioTCM