王明艷　江勵(lì)華　趙鳳鳴　李　育　蔡寶昌

摘 要:目的:探討山茱萸炮制增效活性部位對(duì)老年小鼠骨髓細(xì)胞微核(MN)的影響。方法:取青年組、老年組、用藥組(山茱萸制品幾種溶劑萃取部位)小鼠的骨髓細(xì)胞,檢測(cè)MN,統(tǒng)計(jì)微核率。結(jié)果:老年組與青年組相比,微核率差異顯著,而兩個(gè)用藥組分別用石油醚萃取部位、水煎液灌胃,小鼠骨髓細(xì)胞微核率與老年組相比差異顯著,表現(xiàn)出一定的藥效。結(jié)論:山茱萸制品水煎液及山茱萸制品石油醚萃取部位對(duì)老年小鼠骨髓細(xì)胞DNA有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞:山茱萸;老年小鼠;骨髓;MN

中圖分類號(hào):R283.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1673-2197(2009)06-0007-02

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)的干燥成熟果肉。其味酸、澀,微溫,歸肝腎經(jīng),臨床常用的飲片有山萸肉、酒山萸肉。山茱萸酒蒸后化學(xué)成分發(fā)生了變化,藥性和臨床療效也發(fā)生了很大的變化,其中補(bǔ)益肝腎作用明顯增強(qiáng)。

本課題組完成了“十五”國(guó)家科技攻關(guān)計(jì)劃“山茱萸炮制機(jī)理研究”,篩選出了山茱萸炮制增效活性部位(石油醚萃取部位、正丁醇萃取部位、醇沉多糖部位等)、活性成分(5-羥甲基糠醛、維生素E等),在此基礎(chǔ)上,根據(jù)中醫(yī)補(bǔ)肝腎理論和現(xiàn)代抗衰老理論,對(duì)山茱萸炮制增效活性部位及其成分進(jìn)行進(jìn)一步抗衰老研究,本實(shí)驗(yàn)觀察山茱萸炮制增效活性部位對(duì)老年小鼠骨髓細(xì)胞MN的影響,初步探討山茱萸炮制增效活性部位延緩老年小鼠衰老的作用,為臨床研究提供微觀實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)為進(jìn)一步開發(fā)利用山茱萸這一名貴中藥奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材

山茱萸生品購(gòu)自河南省西峽縣,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為山茱萸(Cornus officinalis Sieb et Zucc.)的干燥成熟果肉,其炮制品由南京中藥飲片廠依據(jù)藥典2000版炮制。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

老齡ICR小鼠,15月齡,40～50g;青年小鼠,3月齡,18～22g,由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證:SCXK(蘇2002-0031)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 山茱萸溶劑萃取部位的制備

取一定量的山茱萸酒蒸品,用10倍量95%乙醇回流提取1.5h,趁熱抽濾,藥渣加10倍量50%乙醇回流提取1.5h,趁熱抽濾,藥渣加10倍量蒸餾水回流提取1.5h,趁熱抽濾,合并濾液,60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮制成浸膏,依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取,萃取物進(jìn)行回旋濃縮,其中石油醚、正丁醇溶劑萃取部位用吐溫-80∶植物油∶水=1∶1∶8配成乳劑在本實(shí)驗(yàn)中備用。

取一定量山茱萸酒蒸品粗粉(過20目篩,去核),加蒸餾水提取1.5h,抽濾,濾液加無水乙醇至醇濃度為80%(V∕V),醇沉,過夜,抽濾,然后收集醇沉粗多糖部位,于50℃真空干燥至恒重,精密稱定多糖的重量,用蒸餾水配成一定濃度的溶液備用。

取一定量山茱萸酒蒸品加適量水浸泡2h,加熱煮沸30min,濾出頭煎,藥渣加水適量,煮沸30min,濾出2煎,將2次濾液合并,加熱濃縮至一定體積備用。

2.2 分組與給藥

取青年小鼠12只,作為青年對(duì)照組;11月齡老齡小鼠60只,常規(guī)飼養(yǎng)至15月齡,隨機(jī)分為5組,分別為老年組和4個(gè)用藥組,均行灌胃給藥,1次/d,連續(xù)30d,給藥劑量根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇、確定,如表1所示。

2.3 MN檢測(cè)

小鼠骨髓細(xì)胞微核(MN)實(shí)驗(yàn):頸椎脫臼處死小鼠,取骨髓細(xì)胞置生理鹽水中,離心,去上清液;加37℃預(yù)溫的0.4%KCl 3mL,置37℃下8min,離心,去上清液;加固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)1mL預(yù)固定,1000轉(zhuǎn)/min條件下離心8min,去上清液;再加固定液4mL混勻,固定兩次后氣干法滴片,Giemsa(1∶10,pH6.4)染色8min。每個(gè)標(biāo)本觀察1000個(gè)細(xì)胞,每組共觀察5000個(gè)細(xì)胞,計(jì)算出微核率,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

小鼠骨髓細(xì)胞微核(MN)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可見:每組觀察5000個(gè)細(xì)胞,老年組與青年組相比,微核率明顯升高,4個(gè)用藥組與老年組相比,石油醚萃取部位和水煎液組微核率顯著下降,P<0.05,反映了藥物的保護(hù)作用。其它藥物組差異不明顯。

微核(Micronucleus)檢測(cè)是檢測(cè)誘變劑和抗變劑靈敏而且可靠的細(xì)胞整體檢測(cè)方法。細(xì)胞受化學(xué)誘變劑作用后,

染色體受損傷而發(fā)生斷裂,喪失著絲點(diǎn)的染色體斷片或染色單體斷片在細(xì)胞有絲分裂后期,遺落在細(xì)胞質(zhì)中,末期后單獨(dú)形成1個(gè)至幾個(gè)小核,即微核。微核的形成反映了染色體受損情況。

遺傳程序說和錯(cuò)誤積累學(xué)認(rèn)為:老化是DNA分子損傷、未得以修復(fù)或錯(cuò)誤積累的直接后果。許多學(xué)者證實(shí):DNA損傷或DNA損傷修復(fù)能力的減弱將加速衰老的進(jìn)程。提高機(jī)體抗DNA損傷或提高其對(duì)DNA損傷修復(fù)的能力將延緩衰老。

本研究結(jié)果表明:老年組小鼠微核率較青年組高,反映了DNA的損傷情況,石油醚萃取部位和水煎液組情況有所改善。前期其它實(shí)驗(yàn)表明:山茱萸石油醚萃取部位和山茱萸水煎液有延緩衰老作用。本實(shí)驗(yàn)提示:其抗衰老作用可能與提高機(jī)體抗DNA損傷或提高對(duì)DNA損傷修復(fù)的能力有關(guān)。本研究為進(jìn)一步深入開展山茱萸活性成分抗衰老研究提供了線索。

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(責(zé)任編輯:陳涌濤)