李華波

摘 要:目的:以冠心病患者外周血單核細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察氟伐他汀對(duì)體外培養(yǎng)的冠心病患者外周血單核細(xì)胞三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)表達(dá)的影響。方法:于冠脈造影時(shí)無菌采集血液標(biāo)本,肝素抗凝,密度梯度離心法分離患者外周血單核細(xì)胞,按作用時(shí)間與濃度分組,分別與10.0μmol/L氟伐他汀作用0h、6h、12h、24h,以及0、1.0、10、100μmol/L濃度的氟伐他汀作用24h。提取各組細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)ABCA1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果:與對(duì)照組比較,10.0μmol/L氟伐他汀作用于單核細(xì)胞6h、12h、24h以及不同濃度的氟伐他汀與單核細(xì)胞孵育24h均不能增強(qiáng)單核細(xì)胞ABCA1 mRNA (P>0.05)。結(jié)論:氟伐他汀不能增強(qiáng)冠心病患者單核細(xì)胞ABCA1的表達(dá)。

關(guān)鍵詞:單核細(xì)胞;氟伐他汀;三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1;動(dòng)脈粥樣硬化

中圖分類號(hào):R541.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1673-2197(2009)06-0012-03

研究表明高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)通過參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用,與冠心病發(fā)病危險(xiǎn)呈獨(dú)立的負(fù)相關(guān)[1]。在RCT過程中,HDL及其載脂蛋白介導(dǎo)外周組織過剩的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟經(jīng)膽汁排泄。ABCA1功能缺陷可導(dǎo)致Tangier病(TD)和家族性HDL缺乏癥(FHD),主要表現(xiàn)為血漿HDL濃度顯著降低和早發(fā)心血管疾病[2]。目前認(rèn)為ABCA1的主要作用是將細(xì)胞內(nèi)膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜外并與載脂蛋白A1結(jié)合,形成新生HDL顆粒,啟動(dòng)RCT過程。由此可見,ABCA1在RCT和HDL生成的起始步驟中起重要作用[3]。他汀類藥物在冠心病的防治中占有重要地位。不僅能通過抑制三羥基三甲基戊二酰輔酶A還原酶阻斷羥甲戊酸(MVA)途徑以及增加肝臟LDL受體表達(dá)而降低血漿LDL-膽固醇的濃度,還能升高HDL,目前對(duì)其升高HDL的機(jī)理尚未闡明。為探討他汀類藥物是否能通過ABCA1途徑升高HDL水平,我們檢測(cè)了他汀類藥物氟伐他汀對(duì)冠心病患者外周血單核細(xì)胞ABCA1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠);TRIzol RNA 提取試劑(Invitrogen 公司);逆轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈反應(yīng)試劑盒(Promega 公司);高保真PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生物工程公司);羊抗人ABCA1—抗(santa cruz 公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊二抗(武漢博士德公司);氟伐他汀原藥粉(cayman公司)。其它試劑與材料均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。ABCA1、GAPDH 引物均由上海旭冠生物科技有限公司合成。

1.2 病例選擇

選擇經(jīng)冠脈造影確診為冠心病的病例10例(凡是血管狹窄等于或大于50%為陽性病變)。所有研究對(duì)象之間沒有血緣關(guān)系,通過問卷訪談收集研究對(duì)象的基本資料、家族史、既往史、吸煙和飲酒史等。并行血常規(guī)、血糖、血脂、肝腎功能、心電圖等相關(guān)檢查。剔除TD以及FHD患者、合并周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病者、惡性腫瘤、入院前4周內(nèi)使用降脂等藥物者。

1.3 單核細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

于冠脈造影時(shí)無菌采集冠心病患者血液標(biāo)本10mL,肝素抗凝,于4℃冰箱靜置30min。生理鹽水1∶1 稀釋。用尖頭吸管輕輕鋪于比重1. 077 淋巴細(xì)胞分離液表面,稀釋血與淋巴細(xì)胞分離液體積比為2∶1,形成清晰界面。離心機(jī)離心20 min,離心后單個(gè)核細(xì)胞懸于分層液面,呈白膜狀。用吸管輕輕將單個(gè)核細(xì)胞吸入另一管內(nèi),PBS 清洗2 次(1 500r/ min,5min)。將清洗后的細(xì)胞重懸于RPMI1640 培養(yǎng)基。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中,置于37 ℃、5 %CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h 后,換液,用37℃預(yù)熱的培養(yǎng)基清洗2 次,將未貼壁細(xì)胞洗脫,瑞氏染色鑒定貼壁細(xì)胞為單核細(xì)胞,占85 %以上。將貼壁細(xì)胞用細(xì)胞刮片輕輕刮下,重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基中,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶/mL,然后將每mL上述細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中。加入干預(yù)因素后于37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

按時(shí)間分:氟伐他汀(10μmol/L):0h(對(duì)照組)、6h、12h、24h組;

按濃度分:氟伐他汀:0(含0.1%DMSO,對(duì)照組)、1.0、10、100 μmol/L組。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

收集各組細(xì)胞,按TRIzol試劑盒說明書提取總RNA。取2μg各組細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再各取2μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別進(jìn)行PCR循環(huán)。ABCA1引物序列:上游5-GTA TTT TTG CAA GGC TAC CAG TTA CAT TTGACA A-3;下游5-GAT TGG CTT CAG GAT GTC CAT GTT GGA A-3。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為177 bp。擴(kuò)增條件:94°C溫育5min,94°C變性40s,60°C復(fù)性30s,72°C延伸30s共32個(gè)循環(huán),末次循環(huán)72℃,延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后,取反應(yīng)產(chǎn)物6μL進(jìn)行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳, Alphalmager 3400 Imaging圖象分析系統(tǒng)攝圖,并分析各組目的基因及GAPDH基因恢度值,以二者的比值代表各目的基因的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用(±s)表示,統(tǒng)計(jì)分析用SPSS10.0軟件,兩組間比較采用方差分析及t 檢驗(yàn),P<0.05 為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

為了觀察單核細(xì)胞與氟伐他汀孵育后ABCA1 mRNA的表達(dá)是否有改變,采用RT-PCR半定量分析各組單核細(xì)胞ABCA1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,10μmol/ L氟伐他汀作用于單核細(xì)胞6h、12h、24h后與作用前比較,各組細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)無明顯變化(P>0.05);單核細(xì)胞與不同濃度氟伐他汀孵育24h后與空白對(duì)照組比較, ABCA1 mRNA表達(dá)亦無明顯變化(P>0.05)。如圖1、圖2所示。

3 討論

單核/巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中起關(guān)鍵作用。循環(huán)血單核細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊部位泡沫巨噬細(xì)胞主要來源之一,血液中單核細(xì)胞遷入動(dòng)脈內(nèi)膜轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞,單核/巨噬細(xì)胞在血管內(nèi)膜攝取氧化低密度脂蛋白、吞噬過量脂質(zhì)以及單核/巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)異常等原因?qū)е履懝檀己椭|(zhì)在單核/巨噬細(xì)胞中大量沉積,形成泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生的重要早期事件。

當(dāng)前,在冠心病的防治中,HDL的作用受到高度重視。HDL對(duì)動(dòng)脈血管壁有直接的保護(hù)作用,并參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)而降低荷脂巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇及磷脂,從而穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊,使動(dòng)脈粥樣硬化病變消退。增強(qiáng)膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn),有利于抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。因此,與HDL代謝相關(guān)的基因備受關(guān)注。ABCA1基因表達(dá)異常能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇沉積,影響HDL的合成與分解,HDL顆粒變小,濃度降低,水平嚴(yán)重缺陷,冠心病的危險(xiǎn)性增加[4]。

在動(dòng)脈粥樣硬化血管性疾病的防治方面,他汀類藥物降低主要的不良終點(diǎn)事件(如死亡、心肌梗死和中風(fēng)等)的療效已超越所有其它的藥物,在臨床上廣泛用于冠心病的防治,具有重要的調(diào)脂作用及改善內(nèi)皮功能、增加纖溶和抗炎癥反應(yīng)等非調(diào)脂作用;不僅能通過抑制三羥基三甲基戊二酰輔酶A還原酶阻斷羥甲戊酸(MVA)途徑以及增加肝臟LDL受體表達(dá)而降低血漿LDL-膽固醇的濃度,還能升高HDL。目前對(duì)其升高HDL的機(jī)理尚未闡明,有報(bào)道認(rèn)為可能是通過降低膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性,以及促進(jìn)載脂蛋白A1生成增加所引起。

盡管ABCA1在HDL生成起始步驟中起關(guān)鍵作用,但與Hitoshi A等所做的普伐他汀對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)的影響研究結(jié)果一致[5],我們的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)他汀類藥物氟伐他汀對(duì)冠心病患者單核細(xì)胞ABCA1的表達(dá)并沒有促進(jìn)作用(P>0.05)。其機(jī)理可能為:一方面,他汀類藥物抑制HMG-CoA還原酶,使中間產(chǎn)物羥甲戊酸(MVA)及終產(chǎn)物膽固醇的生成減少,而膽固醇及氧化固醇在體內(nèi)可誘導(dǎo)LXR及ABCA1的表達(dá);另一方面,他汀類藥能激活核激素受體PPAR-α及PPAR-γ的表達(dá),二者的激活能誘導(dǎo)LXR的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)ABCA1的表達(dá)[6]。他汀類藥對(duì)調(diào)節(jié)ABCA1基因表達(dá)的調(diào)控基因具有雙重效應(yīng),因此,盡管能抑制LXR的表達(dá),但對(duì)ABCA1基因的表達(dá)并沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用。這說明他汀類藥物升高血漿HDL的機(jī)理與ABCA1基因表達(dá)沒有明顯的關(guān)系,若與能增強(qiáng)ABCA1基因表達(dá)的藥物聯(lián)合用藥,將有利于更好地調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。

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(責(zé)任編輯:陳涌濤)

Effects of Fluvastatin on the Expression of ABCA1 in Monocytes of

Patients with Coronary Heart Diseasein Vitro

Li Huabo

(Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Hubei institute for nationalities, Enshi 421001,China)

Abstract:AimThe study was designed to examine the effects of fluvastatin onthe expression of ABCA1 mRNA and protein in monocytes of patients with coronary heart disease in vitro. To evaluate the effect of fluvastatin therapy on antiarteriosclerotic.MethodsMonocytes were isolated by density gradient method from blood ofpatients with coronary heart disease, then divided into different group. Different group monocytesincubated with 10.0μmol/L flivastatin for 0h、6h、12h、24h, or incubated with 0、1.0、10、100 μmol/L flivastatin for 24h, respectived. Total RNA of monocytes were abstracted by TRIzol reagent. The levels of ABCA1 mRNAwere measured by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). ResultsRT-PCR demonstrated that fluvastatin couldnt increase the expression of ABCA1 mRNA in monocytes at different concentrations and times. (compared with control group:P>0.05). Conclusions Fluvastatin couldnt increase ABCA1 mRNA and protein expression in monocytes.

Key words:Monocytes;Fluvastatin;ATP-binding cassette transporter A1(ABCA1);Atherosclerosis