沈晨 郭智霖 歐陽(yáng)火牛

兔面神經(jīng)外傷性損傷后恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究

沈晨 郭智霖 歐陽(yáng)火牛

目的通過(guò)比較兔壓榨性損傷組與正常組的面神經(jīng)功能與組織學(xué)差異，研究面神經(jīng)的損傷及其修復(fù)過(guò)程，為臨床治療周?chē)悦姘c尋找合適的干預(yù)時(shí)機(jī)。方法15只普通級(jí)成年新西蘭兔，分別對(duì)其左側(cè)顳外面神經(jīng)主干施以壓榨性損傷，分別于損傷后2周、4周、6周取材，通過(guò)電生理測(cè)定、顯微結(jié)構(gòu)觀測(cè)及相應(yīng)的組織學(xué)量化分析等方法，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異。結(jié)果損傷后2周時(shí)，大部分軸突顆粒狀變性，髓鞘松解；4周時(shí)，部分軸突恢復(fù)正常；6周后，壓迫組基本恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)，其電生理功能與形態(tài)學(xué)相符。損傷4周后，總體軸突密度為68.88%；6周后，總體軸突密度恢復(fù)至88.63%，與正常組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論兔面神經(jīng)損傷2周后部分神經(jīng)功能開(kāi)始恢復(fù)，至6周時(shí)功能基本恢復(fù)。

家兔損傷面神經(jīng)功能修復(fù)

隨著交通事故等的快速增多，外傷導(dǎo)致的周?chē)悦姘c逐漸成為較常見(jiàn)的臨床疾患。由于顯微神經(jīng)修復(fù)技術(shù)的廣泛運(yùn)用，治療完全性面神經(jīng)損傷已經(jīng)獲得長(zhǎng)足的進(jìn)展。然而，對(duì)于不完全性面神經(jīng)損傷，大部分仍是通過(guò)藥物進(jìn)行治療，這些保守治療方法的發(fā)展有賴(lài)于新藥的開(kāi)發(fā)和促進(jìn)神經(jīng)再生方法的不斷進(jìn)步[1]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)家兔面神經(jīng)壓榨性部分性損傷后的電生理檢測(cè)和組織學(xué)觀察，比較損傷面神經(jīng)和正常面神經(jīng)之間的差別，研究兔外傷性面神經(jīng)損傷后的自我修復(fù)過(guò)程，為臨床部分性面神經(jīng)損傷患者的治療方式選擇和治療時(shí)機(jī)選擇提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

15只普通級(jí)成年新西蘭兔（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重平均2 kg，雌雄不限。分為正常組（n=15）和實(shí)驗(yàn)組（n=5）。

1.2 損傷模型的建立

動(dòng)物用氯胺酮（0.1 mg/kg）肌肉麻醉，加局部浸潤(rùn)麻醉（5%利多卡因）。動(dòng)物俯臥位，按照外科神經(jīng)探查路徑解剖，游離顳外面神經(jīng)主干后，使用血管阻斷夾在面神經(jīng)從莖乳孔潛出部近端0.2 cm的位置造成壓迫性損傷（血管阻斷夾在面神經(jīng)上持續(xù)施壓60 min，相當(dāng)于Sunderland’sⅡ級(jí)損傷）。然后，逐層關(guān)閉術(shù)區(qū)。術(shù)后每只動(dòng)物肌肉注射慶大霉素8萬(wàn)單位，動(dòng)物單籠、常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 電生理檢測(cè)

電生理檢測(cè)采用Medelec Synergy T2生理記錄儀（Oxford instruments公司）。根據(jù)標(biāo)記暴露面神經(jīng)總干損傷部位周?chē)s10 cm，將刺激電極與神經(jīng)干近心端充分接觸，將記錄電極插入口輪匝肌，兩極距離為10 cm。刺激方式為方波刺激，波寬1 ms，測(cè)定口輪匝肌復(fù)合動(dòng)作電位的最大波幅和潛伏期。

1.4 組織學(xué)觀察

術(shù)后2周、4周、6周時(shí)取材行組織學(xué)觀察。1%低聚甲醛固定，并用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖調(diào)pH值至7.3。取出神經(jīng)段為損傷處遠(yuǎn)端并向下延伸0.5 cm。尼康Eclipse E 600（Nikon公司）顯微鏡觀察、拍照，使用Sigma Scan Pro 5.0軟件(Sigma公司)計(jì)數(shù)。

定性分析包括大體神經(jīng)結(jié)構(gòu)、組織成分和再髓鞘化程度。定量分析包括損傷神經(jīng)遠(yuǎn)端有髓神經(jīng)纖維數(shù)量和正常面神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，使用t檢驗(yàn)法和方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 電生理檢測(cè)

損傷后2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組未誘導(dǎo)出復(fù)合動(dòng)作電位，4周、6周時(shí)實(shí)驗(yàn)組均可誘導(dǎo)出口輪匝肌復(fù)合動(dòng)作電位，復(fù)合動(dòng)作電位的最大波幅及峰值潛伏時(shí)間隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸接近正常組（表1）。

表1 口輪匝肌復(fù)合動(dòng)作電位最大波幅和潛伏期

2.2 組織學(xué)觀察

正常神經(jīng)由1～5條神經(jīng)束被紡錘形細(xì)胞組成的神經(jīng)外膜包繞。軸突排列規(guī)則且直徑相似，髓鞘密集，無(wú)退變；雪旺細(xì)胞分布規(guī)則，核的大小及形狀近似；神經(jīng)束膜為一層疏松結(jié)締組織（圖1）。

壓榨性損傷2周后，損傷神經(jīng)的外膜和束膜增厚，有髓軸突顯著減少（大多數(shù)停留在髓鞘化初級(jí)階段），髓鞘極薄而且神經(jīng)直徑纖細(xì)。間質(zhì)稀薄且有少量膠原纖維，還有一些新生血管出現(xiàn)（圖2）。

4周后，損傷神經(jīng)出現(xiàn)更多的有髓軸突，髓鞘化程度明顯增加，有不規(guī)則形狀和大小的軸突出現(xiàn)，軸突直徑增大，髓鞘厚度更厚；同時(shí)雪旺細(xì)胞增多，胞核小而稠密；神經(jīng)外膜和神經(jīng)束膜較正常組厚（圖3）。

損傷6周后，神經(jīng)軸突細(xì)胞器和膠原纖維明顯增多，軸突直徑增粗，髓鞘進(jìn)一步增厚，形成更多的均一軸突；血管數(shù)減少，神經(jīng)外膜變薄，成纖維細(xì)胞和雪旺細(xì)胞數(shù)量減少（圖4）。

2.3 組織學(xué)定量分析

損傷2周后，由于軸突數(shù)量太少，難以準(zhǔn)確測(cè)量，因此被排除在分析范圍之外。

損傷后4周時(shí)的總軸突數(shù)和神經(jīng)橫斷面總面積與正常組有顯著性差異(P＜0.05)；6周時(shí)與正常組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。損傷后4周時(shí)，軸突密度為68.88%，6周時(shí)為88.63%，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 正常面神經(jīng)(尼氏染色，50×)

圖2 面神經(jīng)壓榨性損傷后2周(尼氏染色，100×)

圖3 面神經(jīng)壓榨性損傷后4周(尼氏染色，50×)

圖4 面神經(jīng)壓榨性損傷后6周(尼氏染色，50×)

3 討論

目前，僅有一種標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀糜谘芯客庵苌窠?jīng)損傷，即大鼠的坐骨神經(jīng)損傷模型[2-3]。但對(duì)于面神經(jīng)的研究則沒(méi)有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化模型。面神經(jīng)是具有運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能的混合神經(jīng)，對(duì)于損傷的反應(yīng)與其他外周神經(jīng)并不完全相同[4-8]，沒(méi)有確切的方法可用于量化評(píng)估面神經(jīng)的修復(fù)。

Vasconcelos等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，在兔面神經(jīng)損傷模型中尼氏染色法可用來(lái)明確神經(jīng)元軸突數(shù)，而且可獲得較為精確的神經(jīng)元恢復(fù)數(shù)據(jù)；相比而言，小鼠則表現(xiàn)為非典型的損傷后軸突反應(yīng)，不利于量化評(píng)估面神經(jīng)的修復(fù)[9-10]。另外，兔的面神經(jīng)解剖特征也與人類(lèi)更為近似[11]。

選擇面神經(jīng)主干為受損區(qū)，是由于面神經(jīng)在此處很少有解剖變異[6]，而且也更接近神經(jīng)元胞體，可增大再生率[12]，能更簡(jiǎn)易地評(píng)估神經(jīng)功能情況。

電生理檢測(cè)是評(píng)價(jià)神經(jīng)功能的重要指標(biāo)[13-14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定兔面神動(dòng)作電位最大波幅和潛伏期來(lái)量化恢復(fù)水平。本實(shí)驗(yàn)中，面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)出現(xiàn)在損傷后的4周內(nèi)，與文獻(xiàn)資料相符[5，10]。

1998年，Cai等[1]建立了壓榨性損傷方法，可用于建立Sunderland’sⅡ級(jí)損傷模型。分析計(jì)數(shù)有髓軸突的數(shù)量被許多學(xué)者認(rèn)為是研究神經(jīng)再生的較為客觀的方法[6-7]。但是，大多數(shù)研究只是著眼于連續(xù)區(qū)域的神經(jīng)軸突數(shù)或總軸突數(shù)，而缺乏軸突密度的測(cè)量與比較[5，8]。本實(shí)驗(yàn)中，我們聯(lián)合了以上方法和量化分析，獲得了再生神經(jīng)的量化數(shù)據(jù)。

我們通過(guò)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)間接損傷主要造成軸突的腫脹、髓鞘的板層解離及脫失、膠質(zhì)細(xì)胞增生、毛細(xì)血管破裂出血等改變，且在損傷后1～2周最為顯著。第4周時(shí)，部分軸突及髓鞘出現(xiàn)修復(fù)跡象，6周時(shí)已有明顯修復(fù)，軸突變性壞死后留下的空隙已由膠質(zhì)纖維充填。

[1]Cai ZG,Yu GY,Ma DQ,et al.Experimental studies on traumatic facialnerve injury[J].JLaryngology&Otology,1998,112:243-247.

[2]Buttermeyer R,Rao U,Jones NF.Peripheral nerve allograft transplantation with FK 506 functional,histological,and immunological results before and after discontinuation of immunosuppresion[J]. Ann Plast Surg,1995,35(4):396-401.

[3]De Medinaceli L,Seaber AV.Experimental nerve reconnection: importance of initial repair[J].Microsurg,1989,10(1):56-70.

[4]Labelle Jl,Allen DE.The peripheralnerve repair[J].J Maine Med Assoc,1972,63(8):164-166.

[5]Szal GJ,Miller T.Surgical repair of facial nerve branches.An analysis of different sheathing and suturing techniques[J].Arch Otolaryngol,1975,101(3):160-165.

[6]Spector JG,Lee P,Derby A,et al.Rabbitfacial nerve regeneration in NGF-containing silastic tubes[J].Laryngoscope,1993,103(5): 548-558.

[7]Spector JG,Lee P,Derby A.Rabbit facial nerve regeneration in autologous nerve grafts after antecedent injury[J].Laryngoscope, 2000,110(4):660-667.

[8]Vasconcelos BCE,Gay-Escoda C.Facialnerve repair with expanded plytetrafluoroethylene and collagen conduits:an experimental study in the rabbit[J].J Oral Maxillofac Surg,2000,58(11):1257-1262.

[9]Torvik A.Phagocytosis ofnerve cells during retrograde degeneration. An electron microscopic study[J].J Neuropath Exp Neurol,1972, 31(1):132-146.

[10]Torvik A,Sa-Reide AJ.Nerve cellregeneration after axon lesionsin newborn rabbits[J].J Neuropath Exp Neurol,1972,31(4):683-696.

[11]Kozma C,Macklin W,Cummings LM,et al.Anatomy,physiology and biochemistry of the rabbit[M]//Weisbroth SH,Flatt RE, Kraus AL.The biology of the laboratory rabbit.New York: Academic Press,1974,50-55.

[12]Colli BO.The lesions of the acute traumatic peripheral nerve[J]. Arq Bras Neurosurg,1993,12(4):171-200.

[13]Sittel C,Stennert E.Prognostic value of electromyography in acute peripheralfacialnerve palsy[J].Otol Neurotol,2001,22(1):101-104.

[14]Sinsel NK,Guelinckx PJ,Opdebeeck H.Efect of nerve repair after unilateral partial facial paralysis on craniofacial growth and development[J].Plast Reconstr Surg,1999,104(2):445-463.

Experimental Study on Compression Facial Nerve Injury in Rabbits

SHEN Chen,GUO Zhilin,OUYANG Huoniu.
Department of Neurology Surgery,The Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:GUO Zhilin.

ObjectiveTo study posttraumatic regeneration of the facial nerve in rabbits.Functional and histological analysis were compared with normal nerves on opposite sides to finding the suitable opportunity to treat the peripheral facial paralysis on clinic.MethodsThe left facial nerve trunks of 15 rabbits were selected to compression lesion and the right sides of them serve as the control groups.The rabbits were killed at 2,4 and 6 weeks after the operation,respectively.The obtained specimens were observed macroscopically,microscopically and electrophysiologically.ResultsQualitative analysis demonstrated a degenerative pattern with an increased tissue inflammatory process in the rabbits at 2 weeks after the operation.Electrophysiological evident regeneration signs were observed and almost complete regeneration was seen at 4 and 6 weeks after operation,respectively.The total density(TD)of nerve of the experimental 68.88%and 88.63%at 4 weeks and 6 weeks after the operation,respectively;showing statistically significant differences between experimental and control groups.ConclusionThe partial facial nerve function could recover at 2 weeks of compression lesion.The most nerve function could recover at 6 weeks of compression lesion.Normal nerves showed a significant higher partial density than injured nerves.However,Nerve total density was a more reliable index than partial density in this study.

Rabbits;Injury;Facial nerve;Function;Regeneration

R651.3

A

1673－0364（2009）03－0150－03

2009年3月22日；

2009年5月10日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.009

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院神經(jīng)外科。

郭智霖。