黃秋晴 黎柳 李鴻 譚丹妮 喻嶸

〔摘要〕 目的 基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和實驗驗證探究當(dāng)歸芍藥散對db/db糖尿病腎病小鼠腎臟的保護(hù)機(jī)制。方法 25只8周齡造模成功的db/db小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)均分為模型組（20 mL/kg蒸餾水）、達(dá)格列凈組（1.3 mg/kg）、當(dāng)歸芍藥散低劑量組（8.39 g/kg）、當(dāng)歸芍藥散中劑量組（16.77 g/kg）、當(dāng)歸芍藥散高劑量組（33.54 g/kg），每組5只；另選5只同齡db/m小鼠作為空白組（20 mL/kg蒸餾水）。每組灌胃1次/d，連續(xù)6周。給藥結(jié)束后，檢測各組小鼠體質(zhì)量、空腹血糖（fasting blood glucose， FBG）、口服糖耐量試驗（oral glucose tolerance test， OGTT）的曲線下面積（area under thecurve， AUC）；采用全自動生化分析儀檢測尿白蛋白肌酐比值（urea albumin creatinine ratio， UACR）、甘油三酯（triglyceride， TG）、總膽固醇（total cholesterol， TC）；采用肌酐比色法檢測血肌酐（serum creatinine， Scr）；采用尿素比色法檢測小鼠血尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）；采用HE染色觀察腎臟組織病理形態(tài)；采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)芯片技術(shù)檢測小鼠腎組織差異基因，并對當(dāng)歸芍藥散中劑量組差異基因進(jìn)行KEGG富集分析；采用RT-PCR法檢測表達(dá)量TPM＞10的核心基因在腎臟組織中的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、OGTT-AUC、FBG、UACR、Scr、BUN、TG、TC顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，達(dá)格列凈組、當(dāng)歸芍藥散各劑量組小鼠體質(zhì)量、OGTT-AUC、FBG、UACR、Scr、BUN、TG、TC均降低（P＜0.05，P＜0.01）。與空白組相比，模型組共篩選出1 129個差異基因，其中上調(diào)差異基因337個、下調(diào)差異基因792個。與模型組相比，當(dāng)歸芍藥散共篩選出271個差異基因，其中上調(diào)差異基因195個、下調(diào)差異基因76個?？瞻捉M、模型組、當(dāng)歸芍藥散中劑量組三組差異共表達(dá)基因57個，其中TPM＞10的核心基因共12個，包括Gsta2、Cyp4a12a、Slc8a1、Abcc4、Cpeb4、Serpina1b、Npl、Aacs、Kap、Slc5a10、Tmem252、Ifi27l2a。12個核心基因的mRNA表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組測序趨勢相同。與模型組比較，當(dāng)歸芍藥散中劑量組小鼠Gsta2、Abcc4、Slc8a1、NPL mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05，P＜0.01），Slc5a10、Tmem252 mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.05）。當(dāng)歸芍藥散中劑量組差異基因富集于藥物代謝-細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽代謝、活性氧等相關(guān)通路。結(jié)論 當(dāng)歸芍藥散具有改善糖尿病腎病預(yù)后的作用，其機(jī)制可能與調(diào)控Gsta2、Slc5a10、Abcc4、Slc8a1、Tmem252、Npl等基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽代謝、活性氧等信號通路相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 當(dāng)歸芍藥散；db/db小鼠；糖尿病腎?。晦D(zhuǎn)錄組學(xué)；差異表達(dá)基因；活血利水

〔中圖分類號〕R256.5? ? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.006

Potential mechanism of Danggui Shaoyao Powder on renal protection in

db/db mice based on transcriptomics

HUANG Qiuqing， LI Liu， LI Hong， TAN Danni， YU Rong*

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the renal protective mechanism of Danggui Shaoyao Powder （DGSYP） on diabetic nephropathy in db/db mice through transcriptomics and experimental verification. Methods A total of 25 eight-week-old db/db mice were randomized into model group （20 mL/kg distilled water）， dapagliflozin group （1.3 mg/kg）， low-dose DGSYP group （8.39 g/kg）， medium-dose DGSYP group （16.77 g/kg）， and high-dose DGSYP group （33.54 g/kg）， with five mice in each group. Another five db/m mice of the same age were set as blank group （20 mL/kg distilled water）， and each group was intragastrically administered once a day for six consecutive weeks. After administration， the body weight， fasting blood glucose （FBG）， and area under the curve （AUC） of the oral glucose tolerance test （OGTT） were measured. Urine albumin creatinine ratio （UACR）， triglyceride （TG）， and total cholesterol （TC） were determined by automatic biochemical analyzer. Serum creatinine （Scr） was examined by creatinine colorimetry. The blood urea nitrogen （BUN） was checked by urea colorimetry. HE staining was used to observe the pathological morphology of renal tissue. The differential genes in mouse renal tissue were determined by transcriptome chip technology， and the differential genes of mice in DGSYP group were analyzed by KEGG enrichment analysis. The mRNA expression levels of core genes with TPM>10 in renal tissue were determined by RT-PCR. Results Compared with the blank group， the model group showed significant increases in body weight， OGTT-AUC， FBG， UACR， Scr， BUN， TG， and TC （P<0.01）. Compared with the model group， the dapagliflozin group and DGSYP groups showed decreases in body weight， OGTT-AUC， FBG， UACR， Scr， BUN， TG， and TC （P<0.05， P<0.01）. Compared with the blank group， a total of 1 129 differential genes were screened out in the model group， including 337 up-regulated differential genes and 792 down-regulated differential genes. Compared with the model group， a total of 271 differential genes were screened out in medium-dose DGSYP group， including 195 up-regulated differential genes and 76 down-regulated differential genes. There were 57 differentially expressed genes in the blank group， model group， and the medium-dose DGSYP group， among which there were 12 core genes with TPM>10， including Gsta2， Cyp4a12a， Slc8a1， Abcc4， Cpeb4， Serpina1b， Npl， Aacs， Kap， Slc5a10， Tmem252， and Ifi27l2a. The mRNA expression levels of the 12 core genes were consistent with the transcriptome sequencing trend. Compared with the model group， the mRNA expression levels of Gsta2， Abcc4， Slc8a1， and NPL in the medium-dose DGSYP group increased （P<0.05， P<0.01）， while the mRNA expression levels of Slc5a10 and Tmem252 decreased （P<0.05）. The differential genes in the medium-dose DGSYP group were enriched in drug metabolism-cytochrome P450， glutathione metabolism， and reactive oxygen species， and other related pathways. Conclusion DGSYP can improve the prognosis of diabetic nephropathy， and its mechanism may be related to regulating Gsta2， Slc5a10， Abcc4， Slc8a1， Tmem252， Npl， and other gene expressions as well as modulating cytochrome P450， glutathione metabolism， reactive oxygen species， and other signaling pathways.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Danggui Shaoyao Powder; db/db mice; diabetic nephropathy; transcriptomics; differentially expressed genes; circulating blood and promoting urination

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是最常見的慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）。根據(jù)中國慢性病及危險因素檢測中心在2018—2019年開展的CKD患病率調(diào)查顯示，我國估計有8 200萬人患有CKD[1]。雖然，與之前的全國調(diào)查相比，CKD總體患病率呈下降趨勢，但與糖尿病相關(guān)的CKD患病率由1.2%上升至2.6%[1]。DN是導(dǎo)致全球終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）的主要原因[2]。雖然血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑、鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2抑制劑和鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑等藥物在一定程度上能改善DN的預(yù)后，但其臨床療效仍然有限[3-4]。因此，進(jìn)一步探索DN的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點，開發(fā)預(yù)防及延緩DN進(jìn)展的新策略十分必要。

DN歸屬于中醫(yī)學(xué)“水腫”“關(guān)格”范疇，其關(guān)鍵病機(jī)以脾腎虧虛為本，瘀血、痰濕為標(biāo)，治以培補(bǔ)脾腎、通絡(luò)化痰、活血化瘀[5]。當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略·婦人妊娠病脈證并治第二十》，方中以當(dāng)歸、芍藥為君，養(yǎng)血活血斂陰，川芎、澤瀉為臣，川芎活血行滯，澤瀉淡滲利濕消腫；白術(shù)補(bǔ)脾，恢復(fù)脾胃運化功能，茯苓滲濕，瀉其水邪，共為佐藥。本方川芎、當(dāng)歸、白芍活血而不竣猛，補(bǔ)血而不滯血；白術(shù)、茯苓、澤瀉健脾而不礙濕，利水而不傷脾，以通為主，以補(bǔ)為輔[6]，全方合奏活血利水補(bǔ)虛之功。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸芍藥散可以顯著改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，提示當(dāng)歸芍藥散具有治療DN的潛力[7]。然而，當(dāng)歸芍藥散治療DN的分子生物學(xué)機(jī)制仍未闡明，尚未明確其調(diào)控的潛在基因和靶點。因此，本研究擬采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)手段探究與驗證當(dāng)歸芍藥散對db/db小鼠的保護(hù)機(jī)制，以期為當(dāng)歸芍藥散治療DN的臨床應(yīng)用、探索新的藥理作用提供新的實驗證據(jù)。

1 材料

1.1? 動物

25只6周齡的db/db小鼠和5只6周齡的db/m小鼠均購自江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司，動物許可證號：SYXK（湘）2019-0009，動物合格證編號：202317695。所有動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗動物中心，置于12 h/12 h明暗交替，溫度（24±2） ℃，相對濕度50%±10%的環(huán)境中，提供相應(yīng)的水和食物，自主食用。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號：LL2023042602）。

1.2? 主要藥物及試劑

當(dāng)歸芍藥散由當(dāng)歸、白芍、茯苓、白術(shù)、澤瀉、川芎組成。上述中藥飲片均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房（批號：TH22101801、TH22082301、CK22102401、2022083104、HY22092803、GW23031？鄄

301），經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳勇軍副教授鑒定為正品。達(dá)格列凈（阿斯利康公司，國藥準(zhǔn)字：HJ2017？鄄0119，規(guī)格：10 mg/粒）；葡萄糖注射液（中國大冢制藥有限公司，批號：2H93J5）；肌酐比色法測試盒、尿素比色法測試盒（伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：E-BC-K188-M、E-BC-K183-M）；4%多聚甲醛組織固定液（蘭杰柯科技有限公司，批號：BL539A）。

1.3? 主要儀器

血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司，型號：GA-3）；冷凍離心機(jī)[奧豪斯儀器（上海）有限公司，型號：5515R]；臺式離心機(jī)、超微量分光光度計（賽默飛世爾科技公司，型號：CR4i、NanoDrop 8000）；熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，型號：QuantStudioTM 5 Real-Time PCR System）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海力辰邦西儀器科技有限公司，型號：LC-RE-301）；Spark多功能酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司，型號：30086376）。

2 方法

2.1? 藥物制備

當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略·婦人妊娠病脈證并治第二十》，根據(jù)《方劑學(xué)》[8]中經(jīng)方的臨床等效劑量，當(dāng)歸芍藥散以當(dāng)歸9 g、白芍48 g、川芎24 g、茯苓12 g、白術(shù)12 g、澤瀉24 g為比例進(jìn)行配制。于8倍的蒸餾水中浸泡30 min后，煎煮30 min，倒出藥液，再加入6倍的蒸餾水，煎煮25 min，合并2次煎煮的藥液用紗布過濾，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將過濾后的藥液濃縮至含生藥量2 g/mL，置于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2? 分組及給藥方法

將25只6周齡的db/db模型小鼠和5只6周齡的db/m小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后。測量db/db模型小鼠空腹血糖（fasting blood glucose， FBG），以FBG≥11.1 mmol/L、尿白蛋白肌酐比值（urea albumin creatinine ratio，UACR）≥30 mg/g判定為造模成功[9-10]。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的25只db/db小鼠分為模型組、當(dāng)歸芍藥散低劑量組、當(dāng)歸芍藥散中劑量組、當(dāng)歸芍藥散高劑量組、達(dá)格列凈組，每組5只；另選5只db/m小鼠為空白組。

參照人和動物體表面積[11]的等效劑量系數(shù)折算法，選用70 kg成人藥物用量換算，依據(jù)低、中、高劑量比例1∶2∶4，當(dāng)歸芍藥散低、中、高劑量組用藥分別為8.39、16.77、33.54 g/kg，達(dá)格列凈組1.3 mg/kg予以灌胃[12]，空白組、模型組以20 mL/kg蒸餾水灌胃，每組灌胃1次/d，持續(xù)6周。

2.3? 樣本采集

末次給藥后，各組小鼠禁食不禁水12 h過夜，稱取各組小鼠體質(zhì)量后，使用乙醚進(jìn)行麻醉。將干燥的棉球平鋪于麻醉缸內(nèi)，倒入乙醚，待乙醚揮發(fā)約1 min左右，逐個放入實驗小鼠，待小鼠麻醉后立即取出。使用摘取眼球取血法收集血液樣本，放入4 ℃冷凍離心機(jī)，以3 000 r/min離心15 min（離心半徑6 cm），提取上清液得到血清；迅速打開腹腔取雙側(cè)腎臟，去包膜。左腎取部分腎組織放入4%多聚甲醛固定液中常溫保存。剩余腎組織迅速保存于-80 ℃用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和分子生物學(xué)檢測。

2.4? 觀察指標(biāo)

2.4.1? 基礎(chǔ)指標(biāo)檢測? 灌胃6周后測量小鼠的體質(zhì)量，并用快速血糖儀檢測小鼠FBG[13]。

2.4.2? 口服糖耐量試驗的曲線下面積? 禁食不禁水12 h后，給予每只小鼠10 mL/kg的20%葡萄糖溶液灌胃。取小鼠尾靜脈血液，用血糖試紙分別檢測并記錄小鼠灌胃前及灌胃后30、60、120 min的血糖值，根據(jù)不同時間點的血糖值計算口服糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）的曲線下面積（area under thecurve，AUC）[14]。

2.4.3? 尿液及血清生化指標(biāo)檢測? 尿液指標(biāo)：將小鼠置于代謝籠自由飲水和進(jìn)食。使用代謝籠前先清洗，防止尿液被不明因素污染，每個代謝籠僅放1只老鼠，收集小鼠24 h尿液，尿液標(biāo)本統(tǒng)一送湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科用全自動生化分析儀檢測UACR。

血清指標(biāo)：全自動生化儀檢測各組小鼠血清甘油三酯（triglyceride， TG）、總膽固醇（total cholesterol， TC）；肌酐比色法測試盒檢測小鼠血肌酐（serum creatinine， Scr）；尿素比色法測試盒檢測小鼠血尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）。

2.4.4? 病理學(xué)觀察腎組織病理變化? 取腎組織于4%多聚甲醛中固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋制成蠟塊，4 μm切片，進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2.4.5? 腎臟mRNA測序及分析? 提取小鼠腎臟組織總RNA后，進(jìn)行RNA的質(zhì)量檢測。待樣品質(zhì)檢合格后，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫，使用Nova-seq 6000進(jìn)行高通量測序，文庫構(gòu)建及測序工作由廣州基迪奧生物技術(shù)股份有限公司完成。采用該公司提供的云平臺進(jìn)行差異基因分析，差異基因篩選條件為|log2FC|≥1.5且FDR＜0.05，篩選出空白組vs模型組、模型組vs當(dāng)歸芍藥散中劑量組之間的差異表達(dá)基因（differentially expressed gene， DEG）。使用基迪奧生物平臺網(wǎng)站（https：//www.omicsmart.com/#/）對當(dāng)歸芍藥散篩選出的差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。

2.4.6? 韋恩圖構(gòu)建共同基因? 通過創(chuàng)建韋恩圖確定當(dāng)歸芍藥散中劑量組vs模型組與模型組vs空白組的共同基因。韋恩圖在基迪奧生信云工具上完成，將兩組數(shù)據(jù)集導(dǎo)入網(wǎng)站上的韋恩圖工具中，繪制韋恩圖并獲得交集。以P＜0.05，且表達(dá)值TPM＞10鑒定為核心基因。

2.4.7? 核心基因的RT-PCR驗證? 對核心DEGs的mRNA表達(dá)通過RT-PCR得到證實，將轉(zhuǎn)錄組測序提取的總RNA剩余樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，并按照說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)各組的Ct值，選用β-actin作為內(nèi)參基因，通過2-△△Ct法計算各組樣品mRNA的相對表達(dá)量，引物由廣州基迪奧生物科技有限公司合成，引物序列詳見表1。

2.5? 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)GraphPad Prism 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料結(jié)果以“ｘ±s”表示。滿足正態(tài)性者，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用最小明顯性差異法檢驗；不滿足正態(tài)性資料用Kruskal-Wallis秩和檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組小鼠體質(zhì)量、FBG、OGTT-AUC的比較

與空白組相比，其余各組體質(zhì)量、FBG、OGTT-AUC顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，用藥組的體質(zhì)量、FBG、OGTT-AUC降低（P＜0.05，P＜0.01）；與達(dá)格列凈組相比，當(dāng)歸芍藥散低劑量組FBG、OGTT-AUC顯著增加（P＜0.01），當(dāng)歸芍藥散中、高劑量組OGTT-AUC顯著升高（P＜0.01）；與當(dāng)歸芍藥散低劑量組相比，當(dāng)歸芍藥散中劑量組FBG下降（P＜0.05）。詳見表2、圖1。

3.2? 各組小鼠尿液及血清生化指標(biāo)比較

與空白組相比，模型組TG、TC、UACR、Scr、BUN水平明顯升高（P＜0.01），當(dāng)歸芍藥散低、高劑量組和達(dá)格列凈組TC水平升高（P＜0.05，P＜0.01），當(dāng)歸芍藥散低劑量組UACR水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，達(dá)格列凈組和當(dāng)歸芍藥散各劑量組TG、TC、UACR、Scr、BUN水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表3。

3.3? 各組小鼠腎組織病理變化的比較

空白組小鼠腎小球形態(tài)正常，腎小管排列整齊，腎間質(zhì)未見異常，未見炎性細(xì)胞浸潤。與空白組小鼠相比，模型組小鼠腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)邊界較為清晰，皮質(zhì)區(qū)腎小體結(jié)構(gòu)完整清晰，腎小管結(jié)構(gòu)較為完整，可見蛋白管型和白細(xì)胞管型，系膜細(xì)胞增生明顯，間質(zhì)內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤，亦可見纖維組織增生。與模型組比較，達(dá)格列凈組和中藥各劑量組血管球系膜細(xì)胞輕度增生，腎小管上皮結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤及纖維增生。詳見圖2。

3.4? 小鼠轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估

Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗結(jié)果顯示，空白組、模型組和當(dāng)歸芍藥散中劑量組不同樣本之間均具有較高的相關(guān)性。主成分分析顯示，與空白組相比，模型組及當(dāng)歸芍藥散中劑量組樣本能夠顯著分離，表明各組間的基因存在顯著性差異。詳見圖3。

3.5? 小鼠轉(zhuǎn)錄組DEG分析

與空白組比較，模型組鑒定出1 129個DEG，其中337個DEG上調(diào)、792個DEG下調(diào)；與模型組比較，當(dāng)歸芍藥散中劑量組鑒定出271個DEG，其中195個DEG上調(diào)、76個DEG下調(diào)。聚類分析表明，這些差異表達(dá)的mRNA可以很好區(qū)分空白組與模型組、當(dāng)歸芍藥散中劑量組與模型組。詳見圖4。

3.6? 小鼠轉(zhuǎn)錄組重疊的核心基因表達(dá)

創(chuàng)建模型組vs空白組和當(dāng)歸芍藥散中劑量組vs模型組差異基因的韋恩圖，兩個數(shù)據(jù)集共有57個重疊的DEG，詳見圖5。以P＜0.05，且表達(dá)值TPM＞10為核心基因，共識別出12個基因，即：Gsta2、Cyp4a12a、Slc8a1、Abcc4、Cpeb4、Serpina1b、Npl、Aacs、Kap、Slc5？鄄a10、Tmem252、Ifi27l2a。

3.7? 小鼠腎組織核心基因mRNA表達(dá)水平比較

經(jīng)檢測，各組Gsta2、Cyp4a12a、Slc8a1、Abcc4、Cpeb4、Serpina1b、Npl、Aacs、Kap、Slc5a10、Tmem252、Ifi27l2a mRNA表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組測序趨勢一致。與空白組比較，模型組Slc8a1、Abcc4、NPL、Slc5a10、Tmem252 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05，P＜0.01），Cyp4a12a、Kap mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.01）；當(dāng)歸芍藥散中劑量Gsta2、Slc8a1、Abcc4、NPL mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.01），Aacs、Kap mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.01）。與模型組比較，當(dāng)歸芍藥散中劑量組Gsta2、Abcc4、Slc8a1、NPL mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05，P＜0.01），Slc5a10、Tmem252 mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.05）。詳見圖6。

3.8? 當(dāng)歸芍藥散DEG的KEGG通路富集分析

當(dāng)歸芍藥散調(diào)節(jié)的DEG顯著富集于藥物代謝-細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽代謝、活性氧等相關(guān)通路。詳見圖7。

4 討論

為深入了解當(dāng)歸芍藥散治療DN的作用機(jī)制，本研究采用db/db小鼠作為實驗對象，db/db小鼠具有自發(fā)血糖增高、尿蛋白的特點，且腎損傷隨著年齡的增長而惡化，是理想的研究DN的小鼠模型[15]。本次實驗結(jié)果表明，與模型組相比，達(dá)格列凈組及當(dāng)歸芍藥散各劑量組空腹血糖、體質(zhì)量、OGTT-AUC、TG、TC、UACR、Scr、BUN等各項指標(biāo)均下降，說明當(dāng)歸芍藥散對DN小鼠具有腎臟保護(hù)作用。

Gsta2是編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶α類的基因，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶通過催化活性氧（reactive oxygen species， ROS）等內(nèi)源性產(chǎn)物與谷胱甘肽（glutathione， GSH）的巰基結(jié)合，使其更溶于水從而有利于機(jī)體消除，從而在細(xì)胞解毒中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。Slc5a10是編碼SGLT-5的基因，研究表明，阻斷SGLT-5可使果糖排泄增加，減輕果糖導(dǎo)致的胰島素抵抗和肝脂肪變性，對糖尿病早期體征產(chǎn)生有益影響[17]。多種尿毒癥毒素的滯留和積累是CKD的標(biāo)志之一，促進(jìn)Abcc4基因編碼的轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)有助于多種有毒代謝物的腎臟排泄[18-19]。炎癥和感染會導(dǎo)致細(xì)胞外高Na+水平，觸發(fā)Slc8a1基因編碼的Na+/Ca2+交換器的激活使Na+內(nèi)流、Ca2+外流，同時伴隨活化T細(xì)胞核因子5（nuclear factor of activated T-cell 5， NFAT5）的積累觸發(fā)自噬，減弱高滲應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[20-21]。目前，對于Tmem252基因的研究較少，但是在一項關(guān)于P78-PEDF治療DN的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中，Tmem252同樣作為重要的靶基因，本課題組推測這個基因可能參與DN的發(fā)生發(fā)展[22]。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，當(dāng)歸芍藥散調(diào)控的DEG主要富集于細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽代謝、活性氧等多個信號通路。細(xì)胞色素P450可將花生四烯酸代謝為20-羥基二十碳四烯酸，從而參與腎臟炎癥的發(fā)生，抑制細(xì)胞色素P450通路延緩腎小管炎癥和纖維化[23]。GSH是目前研究最多的細(xì)胞抗氧化劑之一，可防止氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷，2型糖尿病和DN患者的GSH水平降低，處于全身氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)GSH代謝通路，可延緩糖尿病并發(fā)癥的進(jìn)展[24]。機(jī)體高糖狀態(tài)可通過多元醇等途徑導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加，激活核因子-κB、磷酸肌醇3-激酶蛋白/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等相關(guān)通路，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、炎癥、纖維化，導(dǎo)致腎損傷，故抑制ROS相關(guān)通路是治療DN的重要方案[25]。

綜上所述，當(dāng)歸芍藥散能夠降低DN相關(guān)的生化指標(biāo)，改善DN小鼠的腎臟病理損傷，可能通過調(diào)控Gsta2、Slc5a10、Abcc4、Slc8a1、Tmem252、Npl等關(guān)鍵基因表達(dá)，調(diào)控谷胱甘肽代謝、細(xì)胞色素P450、ROS等相關(guān)信號通路，抑制小鼠氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮DN的腎臟保護(hù)作用。轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為單一的組學(xué)研究方法對于機(jī)制的探究存在一定的局限性，后續(xù)可聯(lián)合多組學(xué)方法對當(dāng)歸芍藥散的治療機(jī)制進(jìn)行深入分析。本研究為當(dāng)歸芍藥散干預(yù)DN的作用機(jī)制提供了新的實驗證據(jù)。

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