吳伊瑩 柳玉佳 廖亮英 范伏元 郭志華

〔摘要〕 目的 研究通痹顆粒對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis， CIA）大鼠鐵調(diào)素（hepcidin， Hepc）、Janus激酶（janus kinase， JAK）2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（signal transduction and activator of transcription， STAT）3信號通路的影響。方法 選取36只雌性SD大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、陽性對照組和通痹顆粒低、中、高劑量組，每組6只?？瞻捉M不予處理，其余組用牛Ⅱ型膠原建立CIA模型。造模完成后，空白組、模型組予生理鹽水灌胃，其余各組分別以巴瑞替尼片和低、中、高劑量通痹顆粒灌胃。每天1次，連續(xù)4周。HE染色行滑膜組織病理學(xué)觀察；酶聯(lián)免疫吸附法測定血清Hepc、白細(xì)胞介素6（interleukin 6， IL-6）水平；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法測定滑膜中JAK2、STAT3、細(xì)胞信號因子傳導(dǎo)抑制體（suppressor of cytokine signaling， SOCS）1、SOCS3的mRNA相對表達(dá)量；Western blot法檢測滑膜中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1、SOCS3的蛋白表達(dá)量。結(jié)果 模型組見滑膜上皮結(jié)構(gòu)缺損，滑膜重度增生，排列紊亂，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤和多個血管翳形成；各給藥組滑膜炎癥均有所減輕，陽性對照組優(yōu)于通痹顆粒高劑量組，通痹顆粒中、高劑量組優(yōu)于低劑量組。與模型組相比，各給藥組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分、血清Hepc和IL-6水平均顯著降低（P＜0.01）；與陽性對照組相比，通痹顆粒中、低劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分、血清Hepc和IL-6水平均升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和通痹顆粒低、中、高劑量組JAK2、STAT3 mRNA和蛋白以及p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達(dá)量均降低（P＜0.05），而通路抑制因子SOCS1、SOCS3 mRNA和蛋白的表達(dá)均升高（P＜0.05）；與陽性對照組比較，通痹顆粒各劑量組JAK2、STAT3 mRNA和蛋白以及p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達(dá)量均升高（P＜0.05），而SOCS1、SOCS3 mRNA和蛋白的表達(dá)均降低（P＜0.05）。結(jié)論 通痹顆粒能夠改善CIA大鼠滑膜炎癥，其機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路而減少Hepc的表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；中藥；通痹顆粒；鐵調(diào)素；JAK2/STAT3信號通路

〔中圖分類號〕R285? ? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.005

Effects of Tongbi Granule on collagen-induced arthritis rats based on Hepcidin and JAK2/STAT3 signaling pathway

WU Yiying1，2， LIU Yujia1， LIAO Liangying1， FAN Fuyuan1， GUO Zhihua2*

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study the effects of Tongbi Granule on hepcidin （Hepc） and janus kinase （JAK） 2/signal transduction and activator of transcription （STAT） 3 signaling pathway in collagen-induced arthritis （CIA） rats. Methods A total of 36 female SD rats were randomized into blank， model， positive control， low-， medium-， and high-dose of Tongbi Granule groups， with six rats in each group. CIA model was constructed with bovine type Ⅱ collagen in all groups except the blank group. After modeling， the blank and model groups were given normal saline by gavage， the other groups were given baricitinib tablets， and low-， medium-， and high-dose of Tongbi Granule by gavage respectively， once a day， for continual four weeks. HE staining was performed to observe pathological synovial tissue. Serum Hepc and interleukin 6 （IL-6） levels were measured by ELISA. The mRNA relative expressions of JAK2， STAT3， suppressor of cytokine signaling （SOCS） 1， and SOCS3 in synovium were determined by RT-PCR. Western blot was used to test the protein expressions of JAK2， p-JAK2， STAT3， p-STAT3， SOCS1 and SOCS3 in synovium. Results In the model group， there were defects of synovial epithelium， severe synovial hyperplasia， disordered arrangement， and a large number of inflammatory cell infiltration and pannus formation. However， all administration groups showed reduction of synovial inflammation， the positive control group was better than the high-dose Tongbi Granule group， and the medium- and high-dose groups was better than the low-dose group. Compared with model group， arthritis index scores， and levels of serum Hepc and IL-6 were significantly lower in all drug administration groups （P<0.01）. Compared with the positive control group， the arthritis index scores， serum Hepc and IL-6 levels in low- and medium-dose Tongbi Granule groups were higher （P<0.05）. Compared with model group， the mRNA and protein expressions of JAK2 and STAT3， as well as the protein expressions of p-JAK2 and p-STAT3 were lower （P<0.05）， while the mRNA and protein expressions of pathway inhibitors SOCS1 and SOCS3 were higher in positive control group and low-， medium-， and high-dose Tongbi Granule groups （P<0.05）. Compared with positive control group， the mRNA and protein expressions of JAK2 and STAT3， and the protein expressions of p-JAK2 and p-STAT3 were higher in Tongbi Granule groups of various doses （P<0.05）， while the mRNA and protein expressions of SOCS1 and SOCS3 were lower （P<0.05）. Conclusion Tongbi Granule can relieve synovial inflammation in CIA rats， and its mechanism may be related to inhibiting JAK2/STAT3 signaling pathway and reducing the expression of Hepc.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 rheumatoid arthritis; collagen-induced arthritis; Chinese medicines; Tongbi Granule; hepcidin; janus kinase 2/signal transduction and activator of transcription 3 signaling pathway

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種臨床常見的免疫介導(dǎo)性疾病，以持續(xù)的滑膜炎癥和不可逆的軟骨、骨損傷為主要臨床特點(diǎn)[1]。隨著對RA發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，對小分子靶向藥和生物制劑的探索使用，RA的臨床緩解率已經(jīng)得到了提高，但仍有部分患者遷延難愈[2]。且常規(guī)治療策略中糖皮質(zhì)激素、抗風(fēng)濕藥的大劑量、頻繁和長期給藥，不可避免地導(dǎo)致不良反應(yīng)，患者依從性差[3]。滑膜炎和骨破壞是RA治療的主要切入點(diǎn)，但在臨床中RA的滑膜炎和骨破壞并非完全一致。當(dāng)滑膜炎癥被控制、病情活動度逐漸降低時，軟骨損傷和骨侵蝕仍可繼續(xù)發(fā)展[4]；即使是針對非炎癥的RA治療，以破骨細(xì)胞為靶點(diǎn)同樣可以緩解其骨破壞[5]。因此，在控制關(guān)節(jié)炎癥的同時，尋找滑膜炎和骨破壞機(jī)制中共同的作用靶點(diǎn)，具有重要臨床意義[6]。

鐵調(diào)素（hepcidin， Hepc）具有調(diào)節(jié)機(jī)體鐵狀態(tài)、參與炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)機(jī)體防御機(jī)制的重要作用，Hepc作為一種炎癥介質(zhì)參與了RA滑膜炎的發(fā)病，還是破骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)，Hepc的過表達(dá)可能與RA滑膜炎和骨破壞共同相關(guān)[7]。炎癥信號Janus激酶（janus kinase， JAK）2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（signal transduction and activator of transcription， STAT）3通路與Hepc的分泌相互關(guān)聯(lián)促進(jìn)，是調(diào)節(jié)Hepc的主要信號通路[8]。免疫反應(yīng)時，炎癥因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）與細(xì)胞受體結(jié)合激活STAT3，激活的STAT3與Hepc啟動子結(jié)合進(jìn)而增加Hepc的水平，是Hepc的調(diào)控因子[9]。

通痹顆粒是由當(dāng)歸、黃芪、白芥子、血竭、甘草、僵蠶等多種藥物組成，用于治療血虛痰瘀證RA活動期患者。前期研究表明，通痹顆粒對RA滑膜炎和骨破壞均有一定改善作用[10-12]，但具體機(jī)制尚未完全明確。本實驗通過研究通痹顆粒對RA模型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced Arthritis， CIA）大鼠Hepc、JAK2/STAT3信號通路、IL-6及細(xì)胞信號因子傳導(dǎo)抑制體（suppressor of cytokine signaling， SOCS）的作用，進(jìn)一步明確通痹顆粒治療RA的可能作用機(jī)制，以期為中藥治療RA研究提供依據(jù)并指導(dǎo)臨床治療。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

雌性健康SPF級SD大鼠36只，體質(zhì)量（200±20） g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級中心實驗室，室溫20～25 ℃，相對濕度40%～60%，通風(fēng)、光照良好，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。本實驗嚴(yán)格按照倫理委員會的審查執(zhí)行，倫理審批號：20201010-35。

1.2? 主要藥物與試劑

通痹顆粒（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，主要成分是當(dāng)歸、黃芪、血竭、白芥子、僵蠶、甘草等，規(guī)格：10 g×6包）；巴瑞替尼片（美國禮來公司，批號：H20190039，規(guī)格：2 mg×28片）。

牛Ⅱ型膠原（北京凱詩源生物科技有限公司，貨號：T07-0597）；完全弗氏佐劑（美國Sigma公司，批號：F5881）；兔抗JAK2試劑盒、兔抗STAT3試劑盒、兔抗p-STAT3試劑盒（北京Bioss公司，貨號：bs-23003R、bsm-52235R、bs-22386R）；兔抗p-JAK2試劑盒、兔抗SOCS1試劑盒、兔抗SOCS3試劑盒（美國Affinity公司，貨號：AF3024-100、AF5378、DF6133）；Hepcidin ELISA試劑盒（上海齊源生物科技有限公司，貨號：E4693-100）；IL-6 ELISA試劑盒（武漢艾迪抗生物科技有限公司，貨號：AD40134）。

1.3? 主要儀器

熒光定量RCP儀（美國Bio-rad公司，型號：CFX）；超微量分光光度計（美國Thermo公司， 型號：NanoDrop2000）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（中國北京六一有限公司，型號：DYY-6C、DYCZ-40D）；生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛公司，型號：BioPrep-24）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（廣州勤翔有限公司，型號：Chemiscope6100）。

1.4? 造模與分組

將實驗大鼠隨機(jī)分為6組：空白組、模型組、陽性對照組和通痹顆粒低、中、高劑量組，每組6只?？瞻捉M不予處理，其余各組予牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)造模，具體如下：取牛Ⅱ型膠原溶解于冰醋酸并充分乳化，將乳化后的溶液與完全弗氏佐劑充分混合，制備牛Ⅱ型膠原試劑；將配制好的試劑皮下注射于大鼠于尾部進(jìn)行初次免疫，量約為0.2 mg，2周后再以0.1 mg于尾部進(jìn)行再次免疫；4周后進(jìn)行模型判定，當(dāng)免疫后CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分≥6分，則為造模成功[10]。

1.5? 實驗給藥

造模成功后，空白組、模型組予等量生理鹽水灌胃，其他各組藥物均按照人-大鼠體表面積進(jìn)行換算，以正常人體質(zhì)量70 kg進(jìn)行計算，大鼠體質(zhì)量平均為210 g，換算系數(shù)6.3[13]。其中，陽性對照組以巴瑞替尼片換算為人臨床等效劑量，換算后的等效劑量為0.18 mg/（kg·d）；通痹顆粒低、中、高劑量組分別換算為等效劑量的1/2、1、2倍，換算后分別為0.9、1.8、3.6 g/（kg·d）。均每天灌胃1次，連續(xù)4周。

1.6? 取材及指標(biāo)檢測

1.6.1? 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分? 在造模成功后（第0天）及藥物治療過程（第7、14、21、28天）共計5次評分，根據(jù)大鼠關(guān)節(jié)受累程度不同進(jìn)行相應(yīng)的評分，具體如下：無任何關(guān)節(jié)紅腫為0分；僅足趾關(guān)節(jié)紅腫評為1分；足底及足趾均紅腫評為2分；踝關(guān)節(jié)以下全部紅腫評為3分；全部足踝關(guān)節(jié)均紅腫則評為4分。將大鼠4個關(guān)節(jié)的評分加起來所得分?jǐn)?shù)即為大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，最大值為16分[14]。關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分越高，則大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀越嚴(yán)重。

1.6.2? 取材及處理? 治療4周后處死所有大鼠，予以腹主動脈采血，4 ℃靜置4 h，3 500 r/min離心10 min（離心半徑15 cm），取上清液用于血清Hepc、IL-6水平檢測；將大鼠的左膝關(guān)節(jié)滑膜剝離，福爾馬林液固定，用于滑膜組織病理形態(tài)學(xué)觀察；將大鼠的右膝關(guān)節(jié)滑膜剝離，放入液氮中速凍，-80 ℃條件下封存，用于JAK2/STAT3信號通路相關(guān)基因和蛋白檢測。

1.6.3? 滑膜組織病理學(xué)觀察? 取固定好的滑膜組織，石蠟包埋，制作切片，HE染色，光鏡下（×200）行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.6.4? 酶聯(lián)免疫吸咐法測定各組大鼠血清Hepc、IL-6水平? 取離心好的血清室溫靜置30 min，使用酶聯(lián)免疫吸咐法測定血清Hepc、IL-6水平，具體流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.6.5? 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法測定滑膜組織中JAK2、STAT3、SOCS1、SOCS3的mRNA相對表達(dá)量? 使用Trizol法提取滑膜組織的總RNA，超微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄后獲取互補(bǔ)的cDNA，使用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行定量擴(kuò)增。具體為：預(yù)變性95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s→60 ℃

30 s，擴(kuò)增循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，對目的基因的擴(kuò)增溶解曲線進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)程序分析，采用2-△△ct法計算目的mRNA的相對表達(dá)量?；蛞镄蛄性斠姳?。

1.6.6? Western blot法檢測滑膜組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1、SOCS3的蛋白表達(dá)

將粉碎的滑膜組織進(jìn)行冰上裂解，裂解后離心并取上層清液，使用BCA法測定相關(guān)蛋白濃度，Western blot法電泳后轉(zhuǎn)印于NC膜封閉過夜，將一抗按比例稀釋后與膜一起孵育，4 ℃過夜，次日室溫放置90 min，PBST洗3次；二抗與膜共同室溫孵育90 min后，PBST洗3次，進(jìn)行ECL顯色，并曝光。曝光后底片掃滿，以GAPDH為內(nèi)參，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)軟件分析分子量和灰度值。

1.7? 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件，計量資料以“ｘ±s”表示。若滿足正態(tài)分布和方差齊性者，行單因素方差分析和LSD檢驗；方差不齊者則采用Tamhane' T2法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分變化

造模后，與空白組相比，其余各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分顯著上升（P＜0.01）。經(jīng)治療7 d后，陽性對照組和通痹顆粒各劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分達(dá)到高峰。經(jīng)治療28 d后，與模型組相比，通痹顆粒高、中、低劑量組及陽性對照組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與陽性對照組比較，通痹顆粒中、低劑量組CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1。

2.2? 各組大鼠滑膜組織病理學(xué)觀察

空白組滑膜上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，脂肪細(xì)胞無明顯異常，未見明顯炎癥增生；模型組見滑膜上皮結(jié)構(gòu)缺損，滑膜重度增生，排列紊亂，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤和多個血管翳形成；陽性對照組滑膜結(jié)構(gòu)基本正常，滑膜輕度增生，少量炎癥細(xì)胞，較模型組明顯改善；通痹顆粒低劑量組見滑膜上皮結(jié)構(gòu)缺損，滑膜重度增生，炎癥細(xì)胞浸潤及血管翳形成，較模型組稍輕；通痹顆粒中、高劑量組均見中度滑膜增生及炎癥細(xì)胞浸潤，較低劑量組均減輕，且高劑量組炎癥細(xì)胞浸潤及滑膜增生比中劑量組略輕。詳見圖2。

2.3? 各組大鼠血清Hepc、IL-6水平比較

與空白組比較，模型組和各給藥組大鼠血清Hepc、IL-6水平均升高（P＜0.05）。與模型組比較，通痹顆粒高、中、低劑量組和陽性對照組血清Hepc、IL-6水平均降低（P＜0.05）。與陽性對照組比較，通痹顆粒中、低劑量組血清Hepc、IL-6水平均升高（P＜0.05），通痹顆粒高劑量組血清Hepc、IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

2.4? 各組大鼠滑膜組織JAK2、STAT3、SOCS1、SOCS3的mRNA表達(dá)量比較

與空白組比較，其余各組大鼠滑膜JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)均升高（P＜0.05），SOCS1、SOCS3的mRNA表達(dá)均降低（P＜0.05）。與模型組比較，通痹顆粒高、中、低劑量及陽性對照組JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)均降低（P＜0.05），SOCS1、SOCS3的mRNA表達(dá)均升高（P＜0.05）。與陽性對照組比較，通痹顆粒各劑量組JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)均升高（P＜0.05），SOCS1、SOCS3的mRNA表達(dá)均降低（P＜0.05）。詳見表3。

2.5? 各組大鼠滑膜組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1、SOCS3蛋白表達(dá)比較

與空白組比較，其余各組大鼠滑膜JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），SOCS1、SOCS3蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）。與模型組比較，通痹顆粒高、中、低劑量組和陽性對照組滑膜JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），SOCS1、SOCS3的蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。與陽性對照組比較，通痹顆粒各劑量組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），SOCS1、SOCS3的蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

3 討論

RA是一種炎癥性、慢性自身免疫性關(guān)節(jié)疾病，當(dāng)固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)生異常時，免疫耐受失衡誘發(fā)的損傷顯得尤為關(guān)鍵，這一系列事件將導(dǎo)致持續(xù)的關(guān)節(jié)炎癥、增生性滑膜炎，并最終引起基底層軟骨和軟骨下骨的損傷，導(dǎo)致永久性關(guān)節(jié)破壞、畸形和功能喪失[15]。由于RA常規(guī)治療藥物并不能完全滿足臨床，且存在藥物相關(guān)的耐藥性、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和毒副作用等原因[16]，中醫(yī)藥辨證論治的獨(dú)特優(yōu)勢在RA治療中逐漸凸顯出來。中醫(yī)從整體入手，扶正與祛邪并行，具有多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)、療效確切、毒副作用小等特點(diǎn)，在臨床中得到了廣泛應(yīng)用。

RA屬于中醫(yī)學(xué)“尪痹”“骨骱痹”等范疇。《諸病源候論·風(fēng)濕痹候》載：“由氣血虛，則受風(fēng)濕，而成此病?！薄夺t(yī)級·痹》云：“痹非三氣，患在痰瘀?！彼伢w正氣虧虛，則易感受風(fēng)寒濕邪為患；久痹不愈，則易成瘀血痰濁而遷延受損?；赗A的病機(jī)特點(diǎn)和前期研究[17-18]，本課題組提出了RA的基本病機(jī)是“虛、瘀、痰”，以此為基礎(chǔ)制定了益氣養(yǎng)血、化痰逐瘀的經(jīng)驗協(xié)定方劑通痹顆粒。方中當(dāng)歸為君，溫養(yǎng)活血，舒筋通脈；黃芪為臣，充養(yǎng)元?dú)?，配伍?dāng)歸以共資氣血生化，氣血雙補(bǔ)；血竭散瘀和血止痛，僵蠶、白芥子豁痰散結(jié)、通利消腫，皆為佐藥；甘草為使，緩急溫中健脾，調(diào)和諸藥。既往課題組研究表明，通痹顆粒對RA滑膜炎和骨破壞均有一定的改善作用[19]。黃芪已被證實可調(diào)節(jié)阿爾茨海默病模型小鼠腦組織Hepc的表達(dá)[19]，并可通過JAK2、STAT3免疫炎癥相關(guān)通路治療RA[20]；當(dāng)歸的有效成分當(dāng)歸多糖對慢性炎癥貧血大鼠Hepc的表達(dá)具有抑制效應(yīng)[21]。因此，通痹顆?？赡芡ㄟ^Hepc和JAK2/STAT3信號通路對RA發(fā)揮治療作用。

Hepc是一種具有抗菌特性的肝源性肽，最早于20世紀(jì)初從人的血清和尿液中提純發(fā)現(xiàn)，主要由炎癥細(xì)胞因子尤其是IL-6誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)鐵代謝和參與人體炎癥防御反應(yīng)的重要功能[22]。研究表明，Hepc可以反映RA患者的疾病活動度，其高表達(dá)可以直接加劇RA的炎癥程度，是RA疾病活動度增強(qiáng)的重要原因[23]。促炎因子在RA的病變進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）、IL-6和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor， GMCSF）等驅(qū)動了RA持續(xù)性滑膜炎和全身并發(fā)癥[24]。IL-6作為RA臨床發(fā)病前的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在RA早期滑膜炎的維持和造成關(guān)節(jié)破壞中發(fā)揮主要介導(dǎo)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，與健康者對比，RA組血清Hepc水平顯著升高，且與IL-6的表達(dá)和RA疾病活動度評分呈正相關(guān)，提示Hepc可能直接參與了慢性炎癥的發(fā)病過程[25]；通過藥物對IL-6進(jìn)行抑制，Hepc表達(dá)量明顯減少，證明IL-6與Hepc之間具有高度相關(guān)性[26]。另有研究證實，Hepc在RA中的升高與骨破壞標(biāo)志物正相關(guān)，Hepc的分泌增加促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和骨小梁破壞丟失，提示Hepc可能參與RA的骨破壞[27]；而Hepc的負(fù)調(diào)節(jié)因子紅富鐵激素可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中骨形成蛋白的信號傳導(dǎo)、減少核因子-κβ受體活化因子配體的產(chǎn)生，限制破骨細(xì)胞生成，具有骨保護(hù)作用[28]。因此，Hepc、IL-6與RA的滑膜炎和骨破壞共同相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，通痹顆粒對CIA大鼠滑膜炎癥具有明顯改善作用，可減少滑膜增生和炎癥細(xì)胞浸潤，并且對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分具有一定降低作用。與模型組相比，陽性對照組和通痹顆粒各劑量給藥組均能有效降低CIA血清Hepc和IL-6水平，且陽性對照組療效最佳，通痹顆粒高劑量與陽性對照組之間無明顯差異，提示Hepc與RA的炎癥狀態(tài)存在一定正相關(guān)性，推測通痹顆粒緩解RA滑膜炎和骨破壞的機(jī)制可能與降低血清的Hepc和IL-6水平有關(guān)，且通痹顆粒的療效可能存在一定的劑量依耐性。

Hepc主要通過與細(xì)胞表面的受體膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ferroportin， FPN）結(jié)合后可激活JAK2蛋白激酶，促進(jìn)FPN磷酸化以及內(nèi)化降解，并通過調(diào)節(jié)鐵代謝影響成骨功能[8]。JAK2/STAT3通路受多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，尤其是IL-6和γ干擾素[29]，IL-6可刺激JAK/STAT信號通路促使Hepc表達(dá)，既可加重RA的炎癥反應(yīng)，還可導(dǎo)致貧血、骨破壞。而SOCS家族成員作為JAK/STAT信號通路的代表性負(fù)調(diào)節(jié)因子，可通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和功能參與免疫耐受[30]。相關(guān)研究證實，IL-6可通過JAK2/STAT3信號通路降低十二指腸鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1水平，刺激Hepc的產(chǎn)生[26]；而Hepc也可與膜轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合激活JAK2，并磷酸化轉(zhuǎn)錄因子STAT3，進(jìn)而促進(jìn)IL-6、TNF的表達(dá)[31]；另外，抑制JAK2/STAT3信號通路可以使Hepc的表達(dá)降低，SOCS的轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加，下調(diào)IL-6等細(xì)胞因子的水平進(jìn)而減輕RA的骨破壞[8]。Hepc與JAK2/STAT3信號通路相互作用形成惡性循環(huán)，從而使RA滑膜炎及骨破壞不斷加深加重。通過本實驗進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組對比，陽性對照組和通痹顆粒各劑量給藥組JAK2/STAT3信號通路相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，而通路抑制因子SOCS1、SOCS3的表達(dá)明顯升高，提示通痹顆粒對JAK2/STAT3信號通路具有一定的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，通痹顆粒能有效改善CIA大鼠的滑膜炎及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，對RA具有多靶點(diǎn)的治療作用，降低炎癥因子IL-6水平，其作用機(jī)制與抑制JAK2/STAT3信號通路進(jìn)而減少Hepc的表達(dá)有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，通痹顆粒對Hepc和JAK2/STAT3信號通路的調(diào)節(jié)作用與藥物濃度有關(guān)，因此，臨床探索最合理有效的治療劑量也是接下來的研究重點(diǎn)之一；研究還可以結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，從細(xì)胞分子水平進(jìn)一步探討通痹顆粒對破骨細(xì)胞的具體作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路，以期為治療RA提供新的方法與藥物。

參考文獻(xiàn)

[1] GRAVALLESE E M， FIRESTEIN G S. Rheumatoid arthritis-common origins， divergent mechanisms[J]. The New England Journal of Medicine， 2023， 388（6）： 529-542.

[2] FIRESTEIN G S， MCINNES I B. Immunopathogenesis of rheumatoid arthritis[J]. Immunity， 2017， 46（2）： 183-196.

[3] SHEN Q Y， DU Y Z. A comprehensive review of advanced drug delivery systems for the treatment of rheumatoid arthritis[J]. International Journal of Pharmaceutics， 2023， 635： 122698.

[4] HAYER S， BAUER G， WILLBURGER M， et al. Cartilage damage and bone erosion are more prominent determinants of functional impairment in longstanding experimental arthritis than synovial inflammation[J]. Disease Models & Mechanisms， 2016， 9（11）： 1329-1338.

[5] LARROUTURE Q C， CRIBBS A P， RAO S R， et al. Loss of mutual protection between human osteoclasts and chondrocytes in damaged joints initiates osteoclast-mediated cartilage degradation by MMPs[J]. Scientific Reports， 2021， 11（1）： 22708.

[6] ZHU M L， DING Q， LIN Z X， et al. New targets and strategies for rheumatoid arthritis： From signal transduction to epigenetic aspect[J]. Biomolecules， 2023， 13（5）： 766.

[7] CHEN Y T， XU W， YANG H， et al. Serum levels of hepcidin in rheumatoid arthritis and its correlation with disease activity and Anemia： A meta-analysis[J]. Immunological Investigations， 2021， 50（2/3）： 243-258.

[8] 鄧國倩， 柳玉佳， 吳伊瑩， 等. 鐵調(diào)素在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨代謝中的作用[J]. 風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎， 2023， 12（3）： 62-66.

[9] LANSER L， PLAIKNER M， SCHROLL A， et al. Tissue iron distribution in patients with anemia of inflammation： Results of a pilot study[J]. American Journal of Hematology， 2023， 98（6）： 890-899.

[10] 柳玉佳， 歐慧萍， 吳伊瑩， 等. 通痹顆粒對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)及MMP-3、TIMP-1表達(dá)的影響[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報， 2021， 27（10）： 22-26， 48.

[11] 柳玉佳， 王莘智， 吳伊瑩， 等. 通痹顆粒對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠Wnt信號通路DKK1、β-catenin表達(dá)的影響[J]. 江蘇中醫(yī)藥， 2020， 52（2）： 83-86.

[12] 龍林鈺， 柳玉佳， 吳伊瑩， 等. 通痹顆粒治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床療效及對氧化應(yīng)激的影響[J]. 湖南中醫(yī)雜志， 2023， 39（2）： 18-21.

[13] 劉? 濤， 季? 光. 科研思路與方法[M]. 2版. 北京： 中國中醫(yī)藥出版社， 2016： 95-96， 220-221.

[14] 王敏智， 荊生龍， 何小鵑， 等. CIA大鼠足跖大小與關(guān)節(jié)積分關(guān)聯(lián)研究[J]. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志， 2013， 19（12）： 1417-1419.

[15] CIOBANU D A， POENARIU I S， CRNGU L I， et al. JAK/STAT pathway in pathology of rheumatoid arthritis （Review）[J]. Experimental and Therapeutic Medicine， 2020， 20（4）： 3498-3503.

[16] PRASAD P， VERMA S， SURBHI， et al. Rheumatoid arthritis： Advances in treatment strategies[J]. Molecular and Cellular Biochemistry， 2023， 478（1）： 69-88.

[17] 吳伊瑩， 柳玉佳， 廖亮英， 等. 基于數(shù)據(jù)挖掘的曠惠桃教授治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方藥規(guī)律研究[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2023， 43（1）： 88-94.

[18] 柳玉佳， 王莘智， 曠惠桃， 等. 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中醫(yī)證候、證素分布的臨床研究[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2020， 43（1）： 79-83.

[19] 董賢慧， 賀小平， 張?zhí)熨n， 等. 淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方介導(dǎo)鐵調(diào)素對HT22細(xì)胞中ADAM17表達(dá)的影響[J]. 中國中藥雜志， 2021， 46（23）： 6224-6230.

[20] 姜? 帆， 李慧敏， 林婉娜， 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究黃芪桂枝五物湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制[J]. 廣東藥科大學(xué)學(xué)報， 2023， 39（4）： 49-58.

[21] 李明明， 吳? 俊， 張琪琳， 等. 當(dāng)歸多糖抑制慢性炎癥貧血大鼠體內(nèi)鐵調(diào)素的表達(dá)[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2016， 36（8）： 639-643.

[22] NEMETH E， GANZ T. Hepcidin and iron in health and disease[J]. Annual Review of Medicine， 2023， 74： 261-277.

[23] VAN SANTEN S， VAN DONGEN-LASES E C， VEGT F D， et al. Hepcidin and hemoglobin content parameters in the diagnosis of iron deficiency in rheumatoid arthritis patients with anemia[J]. Arthritis and Rheumatism， 2011， 63（12）： 3672-3680.

[24] RIDGLEY L A， ANDERSON A E， PRATT A G. What are the dominant cytokines in early rheumatoid arthritis？[J]. Current Opinion in Rheumatology， 2018， 30（2）： 207-214.

[25] 張道雨， 劉? 新， 唐? 琪， 等. 北疆地區(qū)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎合并貧血患者血清中Hepc、s-HJV水平與疾病活動的相關(guān)性分析[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報， 2023， 20（17）： 127-131.

[26] ZHAO Y， WANG C Q， YANG T Y， et al. Chlorogenic acid alleviates chronic stress-induced duodenal ferroptosis via the inhibition of the IL-6/JAK2/STAT3 signaling pathway in rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2022， 70（14）： 4353-4361.

[27] GUO H H， XIONG L， PAN J X， et al. Hepcidin contributes to Swedish mutant APP-induced osteoclastogenesis and trabecular bone loss[J]. Bone Research， 2021， 9： 31.

[28] CASTRO-MOLLO M， GERA S， RUIZ-MARTINEZ M， et al. The hepcidin regulator erythroferrone is a new member of the erythropoiesis-iron-bone circuitry[J]. eLife， 2021， 10： e68217.

[29] KOUR G， CHOUDHARY R， ANJUM S， et al. Phytochemicals targeting JAK/STAT pathway in the treatment of rheumatoid arthritis： Is there a future？[J]. Biochemical Pharmacology， 2022， 197： 114929.

[30] YOSHIMURA A， ITO M， MISE-OMATA S， et al. SOCS： Negative regulators of cytokine signaling for immune tolerance[J]. International Immunology， 2021， 33（12）： 711-716.

[31] DOMENICO I D， ZHANG T Y， KOENING C L， et al. Hepcidin mediates transcriptional changes that modulate acute cytokine-induced inflammatory responses in mice[J]. The Journal of Clinical Investigation， 2010， 120（7）： 2395-2405.