黃舒淳 張秋雁 楊漾 李靜 匡慧芳 王明韻

〔摘要〕 目的 基于線粒體鈣穩(wěn)態(tài)探討血府逐瘀湯治療冠心病血瘀證的作用機(jī)制。方法 150只SD大鼠隨機(jī)均分為正常組、假手術(shù)組（只穿線不結(jié)扎）、模型組、阿托伐他汀鈣組（0.90 mg/kg·d，以下簡(jiǎn)稱他汀組）以及血府逐瘀湯低、中、高劑量組[3.51、7.02、14.04 g/（kg·d），以下簡(jiǎn)稱低、中、高劑量組]，每組6只。除正常組和假手術(shù)組外，其他組均通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支制備冠心病血瘀證模型，造模成功24 h后灌胃給藥，連續(xù)灌胃7 d，取各組大鼠左室缺血區(qū)心肌組織。HE染色觀察樣本壞死病變情況；線粒體鈣離子探針檢測(cè)線粒體內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度；定磷法檢測(cè)心肌細(xì)胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性；免疫組織化學(xué)檢測(cè)心肌組織線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（mitochondrial calcium uniporter， MCU）、心肌肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶（sarco/sndoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a， SERCA2a）、瞬時(shí)受體電位通道3（transient receptor potential canonical 3， TRPC3）、鈣釋放激活鈣通道1（calcium release-activated calcium channel protein 1， ORAI1）、半胱氨酸（cysteinyl aspartate specific proteinase， Caspase）-3、Caspase-9的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與正常組相比，模型組大鼠心肌組織可見細(xì)胞排列紊亂，橫紋模糊，大量心肌細(xì)胞壞死，線粒體Ca2+平均熒光強(qiáng)度、MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-3、Caspase-9的AOD值明顯升高（P＜0.01），Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、SERCA2a的AOD值明顯下降（P＜0.01）；與模型組相比，他汀組以及血府逐瘀湯各劑量組，心肌細(xì)胞水腫程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，細(xì)胞排列相對(duì)緊密，細(xì)胞病理損傷程度有所緩解，他汀組以及血府逐瘀湯各劑量組的SERCA2a的AOD值顯著上升（P＜0.01），線粒體Ca2+平均熒光強(qiáng)度、MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-9的AOD值顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），血府逐瘀湯各劑量組的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著上升（P＜0.05，P＜0.01）以及Caspase-3的AOD值顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 血府逐瘀湯可以調(diào)控冠心病血瘀證模型大鼠心肌線粒體鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞線粒體鈣穩(wěn)態(tài)，可能與上調(diào)SERCA2a的蛋白表達(dá)，下調(diào)MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表達(dá)相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 血府逐瘀湯；冠心?。谎鲎C；線粒體；鈣超載

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.004

Mechanism of action of Xuefu Zhuyu Decoction on model rats of

coronary heart disease with blood stasis pattern based on

mitochondrial calcium homeostasis

HUANG Shuchun， ZHANG Qiuyan*， YANG Yang， LI Jing， KUANG Huifang， WANG Mingyun

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the mechanism of action of Xuefu Zhuyu Decoction （XFZYD） in treating coronary heart disease （CHD） with blood stasis pattern based on mitochondrial calcium homeostasis. Methods A total of 150 SD rats were randomized into normal group， sham-operated group （only threading without ligation）， model group， atorvastatin calcium group （0.90 mg·kg-1·d-1， hereinafter referred to as statin group）， and low-， medium-， and high-dose XFZYD groups （3.51， 7.02， 14.04 g·kg-1·d-1， hereinafter referred to as low-， medium-， and high-dose groups）， with six rats in each group. Except for the normal and sham-operated groups， the other groups were prepared for CHD with blood stasis pattern models by ligating the left anterior descending coronary artery of the rats. After 24 hours of successful modeling， the rats were given continuous intragastric administration for 7 d. The myocardial tissue of left ventricular ischemic area in rats of each group was taken. HE staining was used to observe the necrosis of the samples. The fluorescence intensity of calcium ions in mitochondria was determined by mitochondrial calcium ion probe. The Ca2+-Mg2+-ATPase activity of myocardial cells was examined by phosphorus determination method. Immunohistochemistry was used to check the protein expressions of mitochondrial calcium uniporter （MCU）， sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a （SERCA2a）， transient receptor potential canonical 3 （TRPC3）， calcium release-activated calcium channel protein 1 （ORAI1）， cysteinyl aspartate specific proteinase-3 （Caspase-3）， and cysteinyl aspartate specific proteinase-9 （Caspase-9）. Results Compared with the normal group， the model group showed disordered cell arrangement， blurred transverse stripes， necrosis of a large number of myocardial cells， a significant increase in mitochondrial Ca2+ average fluorescence intensity and AOD values of MCU， TRPC3， ORAI1， Caspase-3， and Caspase-9 （P<0.01）， and an obvious decrease in Ca2+-Mg2+-ATPase activity and AOD value of SERCA2a in the myocardial tissue of rats （P<0.01）. Compared with the model group， the statin group and low-， medium-， and high-dose groups showed reduced myocardial cell edema， inflammatory cell infiltration， and cell pathological damage as well as relatively tight cell arrangement， meanwhile， the AOD value of SERCA2a in those groups significantly increased （P<0.01）， and the average fluorescence intensity of mitochondrial Ca2+， AOD values of MCU， TRPC3， ORAI1， and Caspase-9 decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. In addition， the Ca2+-Mg2+-ATPase activity in low-， medium-， and high-dose groups increased significantly （P<0.05， P<0.01）， while the AOD value of Caspase-3 decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion XFZYD can regulate myocardial mitochondrial calcium ion transport and mitochondrial calcium homeostasis in rats of CHD with blood stasis pattern， which may be related to up-regulating the protein expression of SERCA2a and down-regulating the protein expressions of MCU， Caspase-3， and Caspase-9.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Xuefu Zhuyu Decoction; coronary heart disease; blood stasis pattern; mitochondria; calcium overload

冠心病（coronary heart disease， CHD）是冠狀動(dòng)脈粥樣病變導(dǎo)致心肌缺血或壞死的心血管疾病，歸屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”的范疇，血瘀證是CHD中最常見的證型之一[1]。CHD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，多種因素和病理機(jī)制共同作用于本病，而線粒功能障礙是缺血心肌細(xì)胞受損的基本環(huán)節(jié)，線粒體鈣超載是導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)與功能障礙的重要因素[2-3]。心肌缺血發(fā)生發(fā)展的過程中線粒體平衡被打破，ATP生成減少導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升，誘發(fā)線粒體基質(zhì)攝入鈣離子，引發(fā)線粒體鈣超載，進(jìn)一步加劇心肌缺血損傷。因此，減輕線粒體鈣超載對(duì)保護(hù)缺血心肌細(xì)胞有著重要的意義。血府逐瘀湯具有活血化瘀、行氣止痛的功效，是臨床上治療CHD的常用方。血府逐瘀湯干預(yù)CHD的作用機(jī)制以抗血小板集聚，調(diào)節(jié)血脂代謝，改善循環(huán)抗心肌缺血等為主[4]。本課題組前期通過各項(xiàng)研究證實(shí)，血府逐瘀湯可能是通過保護(hù)血管內(nèi)皮、調(diào)控線粒體自噬和代謝、抑制心肌細(xì)胞凋亡等機(jī)制，發(fā)揮保護(hù)缺血心肌的作用[5-7]。本研究以線粒體鈣穩(wěn)態(tài)為切入口，探討血府逐瘀湯調(diào)控線粒體鈣穩(wěn)態(tài)實(shí)現(xiàn)心肌缺血損傷保護(hù)的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療CHD血瘀證的作用機(jī)制提供新的思路與方法。

1 材料和方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠150只，體質(zhì)量220～240 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物合格證號(hào)：NO.430727211100715381，動(dòng)物許可證號(hào)： SYXK（湘）2013-0005，倫理批號(hào)：LL2021040701。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度55%～60%，自由攝食飲水。

1.2? 主要藥品、試劑

血府逐瘀湯：當(dāng)歸9 g，生地黃9 g，桃仁12 g，紅花9 g，枳殼6 g，牛膝9 g，川芎4.5 g，柴胡3 g，赤芍6 g，甘草6 g，桔梗4.5 g；均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心鑒定，符合用藥標(biāo)準(zhǔn)。藥液制備：加10倍量的水浸泡藥物30 min，加熱回流提取1 h，趁熱濾過；再次加入8倍量的水按上法煎煮1 h；合并兩次濾液，濃縮定容為含生藥量1.404 g/mL的藥液。阿托伐他汀片（福建東瑞制藥有限公司，規(guī)格：10 mg×28片，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20193043，產(chǎn)品批號(hào)：042206065）。

Ca2+-Mg2+-ATP酶試劑盒（批號(hào)：A0161-1-1，南京建成生物科技研究所）；MCU抗體（批號(hào)：JM10-20）、SERCA2a抗體（批號(hào)：ER1803-57）、TRPC3抗體（批號(hào)：ER65609）均購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；ORAI1抗體（批號(hào)：Df 7956，美國(guó)Affinity公司）；Caspase-3抗體（批號(hào)：A11319）、Caspase-9抗體（批號(hào)：A11910）均購自美國(guó)Abclonal公司；Rhod-2 AM鈣離子熒光探針[批號(hào)：40776ES，翌圣生物科技（上海）股份有限公司]。

1.3? 主要儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：H1650R），倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司，型號(hào)：DSZ2000X），多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：MB-530），紫外可見分光光度計(jì)（上海天普分析儀器有限公司，型號(hào)：752），熒光定量RCP儀（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：PIKO REAL 96）。

1.4? 動(dòng)物模型制備

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，術(shù)前禁食水24 h。參考李儀奎教授編著的《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)（第2版）》[8]提出的“血瘀證動(dòng)物病理模型建立方法”進(jìn)行動(dòng)物造模。術(shù)前腹腔注射1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉，麻醉后將大鼠固定在鼠板上。于頸部和左側(cè)胸部備皮，行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸比設(shè)置為2∶1，呼吸頻率為90次/min，潮氣量為30 mL，連接BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，觀察并記錄大鼠心電圖變化。大鼠左側(cè)胸部消毒后，于左前第4、5肋間開胸，皮膚切口長(zhǎng)約3 cm，逐層鈍性分離，使用小型拉鉤鉤住肋骨，兩邊拉開，充分暴露心臟，將心包膜撕開，并輕提左心耳，找到肺動(dòng)脈圓錐與左心耳中間的冠脈左前降支（left anterior descending， LAD），距主動(dòng)脈根部2 mm處，以此處為結(jié)扎標(biāo)志，使用6/0無創(chuàng)縫合絲線輕輕穿過左心耳下緣的心肌淺層，將LAD結(jié)扎。以心電圖ST段的改變及左室前壁向外膨脹發(fā)紺為造模成功標(biāo)志，然后將心臟放回胸腔，關(guān)胸，逐層縫合。大鼠自主呼吸恢復(fù)后，拔出氣管。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎，正常組不施加任何干預(yù)措施，其余各組行完全結(jié)扎。術(shù)后肌注青霉素8萬U/只×3 d抗感染。室內(nèi)喂養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。

1.5? 動(dòng)物分組及給藥

將各組SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、阿托伐他汀鈣組（以下簡(jiǎn)稱他汀組）以及血府逐瘀湯低、中、高劑量組（以下簡(jiǎn)稱低、中、高劑量組）。在造模成功24 h后開始灌胃給藥，1日1次，連續(xù)7 d。詳見表1。

1.6? 指標(biāo)檢測(cè)

第7天灌胃后，腹主動(dòng)脈采血，處死動(dòng)物，取出心臟，切取各組左室缺血區(qū)心肌，HE染色及免疫組織化學(xué)所用標(biāo)本經(jīng)生理鹽水沖洗干凈后，使用4%多聚甲醛固定；其余指標(biāo)檢測(cè)標(biāo)本生理鹽水沖洗干凈后，存于無菌凍存管，液氮冰凍保存。

1.6.1? 心肌組織病理學(xué)觀察? 將固定在4%多聚甲醛內(nèi)的心肌組織樣本制成4 μm的石蠟切片，在60 ℃的恒溫箱中烘烤1～2 h。將切片浸置于二甲苯10 min×2次，再將組織切片于梯度（無水、95%、85%、75%）乙醇中進(jìn)行清洗，每級(jí)5 min，再置于蒸餾水中5 min。蘇木素染色約1～3 min，流水沖洗，PBS返藍(lán)。伊紅染色1～3 min，流水沖洗。梯度（無水、95%、85%、75%）乙醇脫水，每級(jí)5 min。再將切片浸置于二甲苯5 min×2次。中性樹膠封片封固。在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)變化并采集圖像。

1.6.2? 線粒體鈣離子熒光強(qiáng)度檢測(cè)? 將心肌組織剪碎，加入3 mL混合酶溶液（0.4%Ⅱ型膠原酶∶0.125%胰酶=2∶1），消化15 min后，棄去上清液。再在組織中加入3 mL混合酶溶液，37 ℃條件下消化8 min后，加入DMEM完全培養(yǎng)基中終止消化，吸取上清液。細(xì)胞懸液在1000 r/min條件下離心5 min后，加入5 mL紅細(xì)胞裂解液重懸，室溫裂解5 min。然后1000 r/min離心5 min，棄去上清液，PBS清洗后加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。吸取掉細(xì)胞培養(yǎng)液后，加入稀釋好的線粒體鈣離子探針，重懸細(xì)胞。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，然后用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行線粒體鈣離子強(qiáng)度檢測(cè)。

1.6.3? 心肌細(xì)胞Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性檢測(cè)? 取大鼠心肌組織，稱定準(zhǔn)確質(zhì)量后，按1∶9質(zhì)量體積比加入蒸餾水后勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL與2 000 μL定磷液勻漿，根據(jù)Ca2+-Mg2+-ATP酶測(cè)試盒的說明進(jìn)行操作，按照定磷法檢測(cè)心肌細(xì)胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。蒸餾水調(diào)零，用1 cm光徑于660 nm處檢測(cè)吸光度值計(jì)算其活性。

1.6.4? 免疫組織化學(xué)檢測(cè)心肌組織SERCA2a、MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表達(dá)? 將心肌組織從固定的多聚甲醛取出后，PBS沖洗，組織脫水后進(jìn)行常規(guī)石蠟切片（4 μm），60 ℃恒溫烤箱烘烤2 h；梯度（無水、95%、85%、75%）乙醇脫蠟復(fù)水。抗原修復(fù)一次，枸櫞酸鈉緩沖液（pH 6.0）放置微波爐中至沸騰后加入組織切片，斷電，間隔5～10 min，重復(fù)1～2次，冷卻置室溫后取出切片，PBS沖洗3次，每次3 min。濕盒中進(jìn)行一抗孵育：適當(dāng)?shù)渭酉♂尩囊豢梗⊿ERCA2a、MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-9、Caspase-3），4 ℃過夜，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫20 min，PBS洗3次，每次2 min。滴加二抗，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色結(jié)果，雙蒸水終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染：3 min，水洗，鹽酸乙醇分色，自來水中促藍(lán)。75%、85%、95%、100%的乙醇，每級(jí)1～2 min。流水沖洗、復(fù)染、脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，用Image J 圖像分析系統(tǒng)分別測(cè)量每張切片中3個(gè)視野MCU、SERCA2a、TRPC3、ORAI1、Caspase-9、Caspase-3的面積積分光密度（integrated optical density， IOD）以及對(duì)應(yīng)的面積（Area），并計(jì)算出平均光密度值（average optical density， AOD），AOD=IOD/Area。

1.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料采用“ｘ±s”表示，滿足正態(tài)性者，不同組間相比采用單因素方差分析（One-WayANOVA），并進(jìn)行組間的多重相比，方差齊時(shí)選擇LSD法，方差不齊時(shí)選擇Dunnett T3法；不滿足正態(tài)性時(shí)選擇秩和檢驗(yàn)。以P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 血府逐瘀湯對(duì)CHD血瘀證模型大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)的影響

正常組與假手術(shù)組，均未見明顯病理形態(tài)改變，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，排列有序，橫紋清晰；與正常組相比，模型組大鼠心肌組織可見細(xì)胞排列紊亂，橫紋模糊，心肌細(xì)胞空泡變性，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大量心肌細(xì)胞壞死；與模型組相比，他汀組和低、中、高劑量組，心肌細(xì)胞水腫程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，細(xì)胞排列相對(duì)緊密，細(xì)胞病理損傷程度有所緩解；與他汀組相比，低、中、高劑量組的心肌細(xì)胞受損情況顯著減輕；與低、中劑量組相比，高劑量組心肌病理損傷程度明顯降低。詳見圖1。

2.2? 血府逐瘀湯對(duì)CHD血瘀證模型大鼠心肌細(xì)胞線粒體Ca2+平均熒光強(qiáng)度的影響

與正常組和假手術(shù)組相比，模型組線粒體Ca2+平均熒光強(qiáng)度明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，他汀組和低、中、高劑量組線粒體Ca2+平均熒光強(qiáng)度明顯下降（P＜0.01）；與他汀組相比，中、高劑量組線粒體Ca2+平均熒光強(qiáng)度明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；與低劑量組相比，中、高劑量組線粒體Ca2+平均熒光強(qiáng)度明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；與中劑量組相比，高劑量組線粒體Ca2+平均熒光強(qiáng)度明顯下降（P＜0.05）。詳見表2、圖2。

2.3? 血府逐瘀湯對(duì)CHD血瘀證模型大鼠心肌細(xì)胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響

與正常組和假手術(shù)組相比，模型組Ca2+-Mg2+-ATP酶活性下降（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，低、中、高劑量組的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性升高（P＜0.05，P＜0.01）；與他汀組相比，中、高劑量組Ca2+-Mg2+-ATP酶活性升高（P＜0.05，P＜0.01）；與低劑量組相比，高劑量組Ca2+-Mg2+-ATP酶活性升高（P＜0.01）。詳見表3。

2.4? 血府逐瘀湯對(duì)CHD血瘀證模型大鼠心肌組織SERCA2a、MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

與正常組和假手術(shù)組相比，模型組SERCA2a的AOD值顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，他汀組和低、中、高劑量組SERCA2a的AOD值顯著升高（P＜0.01）；與他汀組相比，高劑量組SERCA2a的AOD值顯著升高（P＜0.01）；與低劑量組相比，中、高劑量組SERCA2a的AOD值顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與中劑量組相比，高劑量組SERCA2a的AOD值顯著升高（P＜0.05）。詳見表4、圖2。

與正常組和假手術(shù)組相比，模型組MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-3、Caspase-9的AOD值明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，他汀組和低、中、高劑量組MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-9的AOD值明顯下降（P＜0.01），低、中、高劑量組Caspase-3的AOD值顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；與他汀組相比，中、高劑量組MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-3、Caspase-9的AOD值明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；與低劑量組相比，高劑量組MCU、TRPC3、Caspase-3、Caspase-9的AOD值明顯下降（P＜0.01），中、高劑量組ORAI1的AOD值明顯下降（P＜0.01）；與中劑量組相比，高劑量組MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-3、Caspase-9的AOD值明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表4—6，圖2—7。

3 討論

我國(guó)現(xiàn)有約3.3億心血管疾病患者，其中CHD患者1 139萬，且CHD的死亡率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[9]，CHD早已成為我國(guó)的重大公共衛(wèi)生問題，防治CHD刻不容緩。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為CHD的病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)，本虛為氣血陰陽不足、心脈失養(yǎng)，標(biāo)實(shí)為瘀血、氣滯、痰濕、寒凝等痹阻心脈，病位在心。血府逐瘀湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，王清任針對(duì)胸中血瘀證，創(chuàng)立此方，由桃仁、當(dāng)歸、川芎、牛膝、紅花、桔梗、生地黃、柴胡、赤芍、枳殼、甘草11味藥物組成，方中以當(dāng)歸、赤芍、川芎、桃仁和紅花活血為伍，配伍柴胡、桔梗與枳殼等寬胸行氣、調(diào)暢氣機(jī)，全方活血為主，兼以行氣，以奏活血化瘀、行氣止痛之效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，當(dāng)歸和川芎具有保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，其機(jī)制可能是通過穩(wěn)定缺氧心肌細(xì)胞膜，保護(hù)線粒體功能，通過鈣拮抗，抑制細(xì)胞鈣超載，減少缺血區(qū)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10-12]。本實(shí)驗(yàn)中血瘀證模型大鼠在給予血府逐瘀湯之后，心肌細(xì)胞線粒體鈣離子濃度下降，心肌組織病理改變改善，表明血府逐瘀湯對(duì)血瘀證模型大鼠的心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

心肌缺血缺氧后，圍繞梗死血管周圍的缺血心肌組織結(jié)構(gòu)和功能遭受破壞。如何維持心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和能量代謝，減輕心肌細(xì)胞損傷，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)問題。心肌細(xì)胞是對(duì)能量代謝敏感的高耗能細(xì)胞，心肌能量剝奪是缺血性心臟病發(fā)病的關(guān)鍵。線粒體作為細(xì)胞的能量源，其功能障礙在心肌缺血的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[13]。線粒體功能障礙可改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+敏感通路[14]，使胞漿Ca2+水平升高，引起線粒體Ca2+超載，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，調(diào)節(jié)線粒體Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)，減輕線粒體鈣超載能夠改善心肌缺血損傷，有效保護(hù)心肌，對(duì)尋找減輕CHD心肌缺血損傷的作用靶點(diǎn)具有重要意義。

有研究表明，心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)儲(chǔ)存鈣離子和靜息狀態(tài)胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度很低。CHD血瘀證心肌缺血時(shí)心肌細(xì)胞供氧供能水平下降，使得ATP酶SERCA2a和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性下降[15-16]，SERCA2a不能將胞質(zhì)中多余的Ca2+泵到肌漿網(wǎng)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣庫耗竭可激活ORAI1[17]，導(dǎo)致大量Ca2+向心肌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，線粒體攝取細(xì)胞內(nèi)過量Ca2+調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡[18]，線粒體電子傳遞失衡導(dǎo)致線粒體能量代謝下降在心臟缺血期間維持進(jìn)行性損傷[19]。同時(shí)，線粒體鈣超載導(dǎo)致Ca2+依賴性離子通道開放，線粒體膜通透性改變，線粒體結(jié)構(gòu)受損，誘導(dǎo)線粒體向細(xì)胞質(zhì)中釋放一系列促凋亡因子結(jié)合成凋亡復(fù)合體，激活Caspase-9，Caspase-9的啟動(dòng)進(jìn)而激活下游Caspase-3進(jìn)入不可逆的凋亡過程，這些變化因素最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡[20]。

線粒體通過機(jī)制調(diào)節(jié)Ca2+的信號(hào)傳導(dǎo)，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，影響著細(xì)胞的有氧代謝和生存死亡[21]。MCU復(fù)合物活化和線粒體鈣超載是心血管疾病的潛在機(jī)制[22]。MCU是線粒體Ca2+攝取的最主要離子通道[23]，是鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。但MCU不是線粒體攝取Ca2+的唯一通路，44%的總經(jīng)典TRPC3定位于線粒體內(nèi)膜，當(dāng)線粒體外鈣離子濃度較高時(shí)大量Ca2+可以通過TRPC3進(jìn)入線粒體[24]。這些鈣離子通道在線粒體維持鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。

因此，維持線粒體鈣穩(wěn)態(tài)保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)與功能的完整性對(duì)保護(hù)心肌細(xì)胞生理功能具有重要的意義，影響能量代謝，細(xì)胞凋亡[25]。有研究表明[26-27]，抑制線粒體鈣超載，能有效保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)，抑制線粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞。

本研究結(jié)果顯示，血府逐瘀湯可以明顯改善缺血心肌組織病理形態(tài)，在低、中、高劑量組中，高劑量組效果最佳；血府逐瘀湯可以降低線粒體內(nèi)鈣離子濃度，調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，可能與提高心肌組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、上調(diào)SERCA2a的蛋白表達(dá)、下調(diào)MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表達(dá)有關(guān)。

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