程曉芳 鄒貴香 周寧菱 劉思萌 黃永芳 馮超義

摘 要：建立一種快速檢測堿水粑中脫氫乙酸含量的高效液相色譜方法。方法：稱取5 g樣品，經(jīng)10%乙醇溶液提取、硫酸鋅溶液+氫氧化鈉溶液沉淀蛋白質(zhì)，定容至25 mL，高速離心后取上層清液過濾膜，經(jīng)高效液相色譜儀在293 nm檢測波長下進(jìn)行檢測。結(jié)果：脫氫乙酸濃度在1.00～200.00 μg·mL-1時與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8；方法檢出限為0.001 3 g·kg-1，定量限為0.004 g·kg-1；經(jīng)方法學(xué)驗證結(jié)果表明，加標(biāo)回收率為92.42%～98.65%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%～2.50%。結(jié)論：本方法能夠快速且準(zhǔn)確地檢測出堿水粑中脫氫乙酸的含量，適合在基層檢驗檢測機(jī)構(gòu)推廣普及，具有一定的實際應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；脫氫乙酸；堿水粑

Determination of Dehydroacetic Acid in Alkaline Water Cake by HPLC

CHENG Xiaofang1， ZOU Guixiang2， ZHOU Ningling1， LIU Simeng1， HUANG Yongfang1， FENG Chaoyi1

（1.Jingdezhen Market and Quality Supervision and Management Comprehensive Inspection and Testing Center， Jingdezhen 333000， China; 2.Ganzhou Shangyou County Military Grain Supply Station， Ganzhou 341200，China）

Abstract： A high performance liquid chromatography method for dehydroacetic acid in alkaline water was established. Method： 5 g of samples were weighed， extracted by 10% ethanol solution， zinc sulfate solution+sodium hydroxide solution， and settled to 25 mL. After centrifugation， the supernatwas filtered and tested at 293 nm by high-performance liquid chromatography. Result： Dehydroacetic acid concentration was from 1.00 to 200.00 μg·mL-1， the correlation coefficient R2=0.999 8， the detection limit of the method was 0.001 3 g·kg-1， the quantification limit was 0.004 g·kg-1; the recovery rate was 92.42%～98.65% and relative standard deviation ?was 1.32%～2.50%. Conclusion： This method can quickly and accurately detect the content of dehydroacetic acid in the alkaline water cake， which is suitable for the popularization in the basic inspection and testing institutions， and has certain practical application value.

Keywords： high performance liquid chromatography; dehydroacetic acid; alkali water cake

堿水粑又稱“灰水糕”“灰水果”，是江西景德鎮(zhèn)市的一種本土特色美食，由大米磨漿后加入堿水，通過特制的粑篩猛火蒸煮而成，厚度一般10 cm左右[1]。隨著景德鎮(zhèn)市旅游業(yè)的發(fā)展，堿水粑這一傳統(tǒng)美食也受到了越來越多外地旅客的歡迎，其生產(chǎn)需求量也日益增大。許多不法商販為延長堿水粑的保質(zhì)期，常會在生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)加入過量的防腐劑，特別是脫氫乙酸。脫氫乙酸（Dehydroacetic Acid，DHA）又稱脫氫醋酸，常溫下呈白色或淡黃色的結(jié)晶性粉末，不易溶于水，易溶于堿性溶液，是一種低毒高效的新型防腐、防霉劑，其抑菌的效果基本不受食品酸堿度的影響，對霉菌、酵母菌等真菌以及細(xì)菌等微生物的生長有顯著的抑制作用[2-5]。人體若攝入過多的DHA則會對健康產(chǎn)生一定危害，可能會出現(xiàn)腸胃不適、代謝紊亂、過敏反應(yīng)等一系列副作用[6]。因此，準(zhǔn)確且快速地檢測食品中DHA的含量對DHA這一防腐劑的使用管控具有非常重要的意義。

目前，測定DHA含量的方法主要有液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[7-11]，參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）中的前處理方法，本文對國標(biāo)方法中提取劑、蛋白沉淀劑、流動相及流動相比例等條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高檢驗檢測效率，以期建立一種快速、準(zhǔn)確測定堿水粑中脫氫乙酸含量的檢測方法，為更多基層檢驗檢測機(jī)構(gòu)測定堿水粑中脫氫乙酸含量提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品：堿水粑，購自景德鎮(zhèn)市本地市場。試劑：脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，含量100 mg，純度99.9%，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醇、乙腈，色譜純，上海捷世凱生物科技有限公司；乙酸銨、硫酸鋅、氫氧化鈉，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；無水乙醇，分析純，鎮(zhèn)江久億化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Arc HPLC液相色譜儀，配置2998二極管陣列檢測器；ChromCore C18-AC色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；超純水機(jī)（Millipore EXPRESS40）；

萬分之一電子天平（PX-224ZH/E）；十萬分之一電子天平（CPA225D）；臺式離心機(jī)（DT45H），湖南可成儀器設(shè)備有限公司；多管渦旋儀（KN-026S），北京科德諾思技術(shù)有限公司；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE），昆山市超聲儀器有限公司（舒美）。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液配制

乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）：稱取1.54 g乙酸銨，溶于水并稀釋至1 L；氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）：稱取20 g氫氧化鈉，溶于水并稀釋至1 L；硫酸鋅溶液（120 g·L-1）：稱取120 g硫酸鋅，溶于水并稀釋至1 L；乙醇溶液（10%）：50 mL無水乙醇用水稀釋至500 mL。

1.3.2 建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

準(zhǔn)確稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品50.05 mg于50 mL容量瓶中，用10 mL的NaOH溶液溶解，加水定容得到DHA標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1.0 mg·mL-1）。分別吸取DHA標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.10 mL、1.00 mL、5.00 mL、10.00 mL和20.00 mL于100 mL容量瓶中，加水定容。配制成濃度為1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1、100.0 μg·mL-1和200.0 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 液相色譜條件

本實驗選擇ChromCore C18-AC色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇+0.02mol·L-1乙酸銨（體積比為10∶90，）；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：293 nm；柱溫：30 ℃。

1.3.4 樣品前處理

稱取粉碎、均質(zhì)后的樣品約5 g（精確至0.001 g），置于50 mL離心管中，加入10 mL乙醇溶液（10%）、5 mL硫酸鋅溶液（120 g·L-1）、1 mL氫氧化鈉溶液

（20 g·L-1），渦旋振搖5 min，加水稀釋至25 mL刻度線，4 000 r·min-1離心5 min。取上清液過0.45 ?m水相濾膜，供高效液相色譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

選用甲醇+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液、乙腈+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液、甲醇+水以及乙腈+水4種流動相進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用乙腈+水和甲醇+水這兩種流動相時，脫氫乙酸的峰型拖尾十分嚴(yán)重，保留時間過長，分離效果并不理想；而甲醇+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液和乙腈+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液作為流動相時脫氫乙酸峰型對稱性較好，拖尾現(xiàn)象得到明顯改善，出峰時間也較為合適，同時考慮到甲醇與乙腈相比價格更加實惠，故最終選擇甲醇+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液作為流動相，以降低基層檢驗檢測機(jī)構(gòu)的檢測成本。

2.2 流動相比例的選擇

在脫氫乙酸經(jīng)高效液相色譜測定分析過程中發(fā)現(xiàn)，流動相中甲醇的比例對脫氫乙酸峰型及保留的時間長短影響很大，若色譜峰分離的效果不好、拖尾的現(xiàn)象嚴(yán)重就會導(dǎo)致最終測定含量的不準(zhǔn)確。因此，比較了不同流動相比例（甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸銨溶液=5∶95、甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸銨溶液=10∶90、甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸銨溶液=15∶85）的脫氫乙酸的色譜圖，詳見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動相中甲醇比例為5%時，脫氫乙酸出峰時間為9.213 min，峰型存在明顯的拖尾，保留時間將近3 min；當(dāng)流動相中甲醇比例為10%時，脫氫乙酸出峰時間提前至7.568 min，保留時間也大大縮短，峰型拖尾現(xiàn)象得到明顯改善，對稱性較好；當(dāng)流動相中甲醇比例為15%時，脫氫乙酸出峰時間為

5.725 min，保留時間縮短至1 min左右，峰型對稱性與流動相中甲醇比例為10%時差不多，考慮到出峰時間過早可能會導(dǎo)致樣品中雜質(zhì)分離效果不理想，因此，為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時提高基層檢驗檢測效率，最終選擇流動相比例為甲醇+0.02 mol·L-1乙酸銨=10∶90進(jìn)行脫氫乙酸含量測定分析。

2.3 蛋白沉淀劑的選擇

由于堿水粑中含有豐富的蛋白質(zhì)，因此在前處理過程中必須進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，常見的蛋白沉淀劑有乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、氫氧化鈉和硫酸鋅，本實驗對3種不同蛋白沉淀組合劑（亞鐵氰化鉀+乙酸鋅、亞鐵氰化鉀+硫酸鋅、氫氧化鈉+硫酸鋅）回收率情況進(jìn)行比較。由表1可知，氫氧化鈉+硫酸鋅組合作為測定蛋白沉淀劑時回收率最高，同時考慮到脫氫乙酸易溶于堿性溶液，且配制脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品時也需用氫氧化鈉溶液進(jìn)行溶解，故最終決定選用氫氧化鈉+硫酸鋅作為本次實驗的蛋白沉淀劑。

2.4 提取劑的選擇

本實驗選擇水、乙醇、甲醇、10%乙醇溶液和10%甲醇溶液這5種溶液分別作為提取劑提取樣品中的脫氫乙酸。2種不同加標(biāo)濃度（0.05 g·kg-1和

0.50 g·kg-1）的樣品經(jīng)5種提取劑提取后回收率結(jié)果見表2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10%乙醇溶液提取的脫氫乙酸回收率最高，故最終選擇10%乙醇溶液作為提取劑。

2.5 方法學(xué)驗證結(jié)果

2.5.1 脫氫乙酸線性范圍

將1.3.2配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按1.3.3色譜條件進(jìn)行測定，以脫氫乙酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖2所示。結(jié)果顯示脫氫乙酸濃度在1.0～200.0 μg·mL-1時，線性關(guān)系良好，回歸方程為y=20 289x+12 291，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

2.5.2 檢出限、定量限

以S/N=3計算檢出限，S/N=10計算定量限，當(dāng)取樣量為5 g時，脫氫乙酸最低檢出限為0.001 3 g·kg-1，定量限為0.004 g·kg-1。優(yōu)于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）中對檢出限和定量限的要求。

2.5.3 方法回收率、精密度

以空白堿水粑為基底，按0.05 g·kg-1，0.25 g·kg-1，0.50 g·kg-1共3個水平加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個加標(biāo)水平平行測定6次，計算脫氫乙酸回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值。由表3可知，在本研究條件下堿水粑中脫氫乙酸的加標(biāo)回收率為92.42%～98.65%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%～2.50%，結(jié)果符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，因此，本研究方法滿足日常對堿水粑中脫氫乙酸含量的測定。

3 結(jié)論

本研究探討了檢測堿水粑中脫氫乙酸含量的方法。實驗表明，選擇甲醇+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液作為流動相，且甲醇+0.02 mol·L-1乙酸銨=10∶90時，脫氫乙酸峰型對稱性最好，拖尾現(xiàn)象得到改善；氫氧化鈉+硫酸鋅作為蛋白沉淀劑，10%乙醇溶液作為提取劑時，堿水粑中脫氫乙酸含量測定的回收率最高，確保了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。以空白堿水粑作為底物，添加不同濃度水平脫氫乙酸做方法學(xué)驗證，得到的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果都符合標(biāo)準(zhǔn)要求。綜上所述，本文建立的高效液相色譜測定堿水粑中的脫氫乙酸含量的方法具有操作簡便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性較好，適合在基層檢驗檢測機(jī)構(gòu)推廣普及，具有一定的實際應(yīng)用價值。

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