李俊毅 李窕妍

摘 要：采用全自動(dòng)固相萃取儀，建立適用于糧食中黃曲霉毒素B1的檢驗(yàn)方法。樣品經(jīng)提取液提取，用全自動(dòng)固相萃取-免疫親和柱凈化，采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)（High Performance Liquid Chromatography-Fraunhofer Line Discriminator，HPLC-FLD）柱后衍生法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1在0.1～

20.0 ng·mL-1線性良好，R2為0.999 987；檢出限和定量限分別為0.03 μg·kg-1和0.1 μg·kg-1；3水平加標(biāo)回收率為84.9%～88.5%。本方法自動(dòng)化程度高、重現(xiàn)性好，可以滿足糧食中黃曲霉毒素B1測(cè)定的要求。

關(guān)鍵詞：全自動(dòng)固相萃?。桓咝б合嗌V-熒光檢測(cè)；柱后衍生；黃曲霉毒素B1

Determination of Aflatoxin B1 in Grain by Automatic Solid Phase Extraction with HPLC-FLD Post-Column Derivatization

LI Junyi1， LI Tiaoyan2

（1.Jieyang Institute of Food Inspection， Jieyang 522000， China;

2.Guangdong Province Jieyang City Quality Measurement Supervision and Testing Institute， Jieyang 522000， China）

Abstract： A fully automatic solid-phase extractor was used to establish a method for the detection of aflatoxin B1 in grain. The samples were extracted by extraction， cleaned up with automatic solid-phase extraction-immunoaffinity column， and determined by high performance liquid chromatography-fraunhofer line discriminator （HPLC-FLD） post-column derivatization. The results showed that aflatoxin B1 had good linearity at 0.1～20.0 ng·mL-1， R2 was

0.999 987， and the limits of detection and quantification were 0.03 μg·kg-1 and 0.1 μg·kg-1， respectively. The recovery rate of horizontal spiking was 84.9%～88.5%. This method has a high degree of automation and good reproducibility， which can meet the requirements of the determination of aflatoxin B1 in grains.

Keywords： automatic solid phase extraction; high performance liquid chromatography-fraunhofer line discriminator; post-column derivations; aflatoxin B1

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一種雙呋喃環(huán)類毒素，屬于真菌類毒素，常見的黃曲霉毒素可分為B族、G族和M族三大類，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素及其衍生物超過20種[1]。黃曲霉會(huì)污染糧食、堅(jiān)果、油脂及其制品，如大米、小麥、瓜子、大豆油等[2]。食品被黃曲霉和寄生曲霉污染后都可能會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素，其中AFTB1的毒性最強(qiáng)[3]，會(huì)對(duì)人體健康造成極大的危害，屬Ⅰ類致癌物。

食品中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法主要有液質(zhì)聯(lián)用法[4]、高效液相色譜法[5]、QuEChERS法結(jié)合其他檢測(cè)方法[6]、酶聯(lián)免疫吸附篩查法[7]以及薄層層析法等[8]。其中，高效液相色譜法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)人員易上手，儀器的使用和維護(hù)成本較低，檢測(cè)靈敏度高、穩(wěn)定性好[9]。本研究在國(guó)標(biāo)方法高效液相色譜-熒光檢測(cè)（High Performance Liquid Chromatography-Fraunhofer Line Discriminator，HPLC-FLD）柱后衍生法的基礎(chǔ)上，對(duì)前處理方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，結(jié)合全自動(dòng)固相萃取儀-免疫親和柱對(duì)樣品進(jìn)行全自動(dòng)凈化，有效解決了人工過柱流速不穩(wěn)定、重現(xiàn)性較差、大批量樣品處理效率不高等問題，避免了前處理階段由人員操作帶來的系統(tǒng)誤差，提升了工作

效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陰性大米樣品；市售大米樣品；甲醇、乙腈；乙腈中黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg·mL-1），阿爾塔。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695/2475高效液相色譜儀，配熒光檢測(cè)器和柱后衍生系統(tǒng)；AflaStar黃曲霉毒素免疫親和柱（3 mL，200 ng）；Fotector-02HT全自動(dòng)固相萃取儀，Reeko公司；AutoEVA-20Plus全自動(dòng)平行濃縮儀，Reeko公司；V20垂直振蕩器，RayKal公司；BSA224S-CW電子天平，Sartorius公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢測(cè)條件

Symmetry C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；等梯度洗脫；流動(dòng)相：水+乙腈+甲醇（68+16+16）；流速：1 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；激發(fā)波長(zhǎng)：360 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：440 nm；柱后衍生溶液：0.05%碘溶液；衍生溶液流速：0.2 mL·min-1；衍生反應(yīng)管溫度：70 ℃。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

精確移取0.5 mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

（100 μg·mL-1）至5 mL容量瓶中，用乙腈稀釋混勻，得到10.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精確移取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL容量瓶，用乙腈稀釋混勻，得到100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。用流動(dòng)相（水+乙腈+甲醇，68+16+16）將標(biāo)準(zhǔn)中間液分別稀釋成

0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，供高效液相色譜儀測(cè)定。

1.3.3 樣品的制備

稱取5 g預(yù)先充分粉碎均勻的大米樣品至50 mL離心管，加入20 mL 70%的甲醇溶液，漩渦混合后置于垂直振蕩器中，以1 000 r·min-1振蕩20 min，

6 500 r·min-1離心10 min。移取4 mL上清液至進(jìn)樣管中，加入38 mL 1%曲拉通X-100的PBS，充分混合均勻。將上述樣液置于高通量全自動(dòng)固相萃取儀中萃取，收集洗脫液至20 mL濃縮管中，置于全自動(dòng)平行濃縮儀，于50 ℃條件下將洗脫液氮吹至近干，用流動(dòng)相定容至1.0 mL，置于渦旋混合器中渦旋30 s溶解殘?jiān)?，?.22 μm PTFE濾膜過濾，測(cè)定。固相萃取程序見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限

將1.3.2項(xiàng)系列標(biāo)準(zhǔn)工作液注入液相色譜儀，以黃曲霉毒素B1的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到黃曲霉毒素B1的線性回歸方程為Y=3.76×106X-6.31×104，相關(guān)系數(shù)R2為

0.999 987，在0.1～20.0 ng·mL-1線性關(guān)系良好。

依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》（GB 5009.22—2016）的規(guī)定，當(dāng)稱取樣品5 g時(shí)，高效液相柱后碘衍生法測(cè)定AFTB1的檢出限（Limit of Detection，LOD）為

0.03 μg·kg-1，定量限（Limit of Quantification，LOQ）為0.1 μg·kg-1[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，稱取

5 g陰性樣品，加入1.5 μL 100 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)中間液，按照1.3.3項(xiàng)方法進(jìn)行樣品制備，測(cè)得黃曲霉毒素B1的S/N值為34.18，滿足S/N≥3的要求，且峰型清晰可辨（見圖1），因此確定本方法AFTB1的LOD為

0.03 μg·kg-1；同理，確定本方法AFTB1的LOQ為

0.1 μg·kg-1。

2.2 精密度與加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

在陰性樣品中，采用外加法添加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別制備1×LOQ、2×LOQ、10×LOQ

3個(gè)添加濃度的加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度制備3個(gè)平行，按照1.3.3項(xiàng)方法進(jìn)行樣品制備，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2可以看出，3個(gè)添加水平下，平均加標(biāo)回收率在84.9%～88.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）在2.24%～4.92%，符合《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》（GB/T 27417—

2017）的規(guī)定，方法準(zhǔn)確可靠。

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

在多個(gè)商場(chǎng)、超市和市場(chǎng)隨機(jī)采集30批次的大米樣品，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，其中有13批次的樣品檢出AFTB1，含量在0.276～2.272 μg·kg-1。抽查的30批次大米樣品中AFTB1含量均小于10 μg·kg-1，符合《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》

（GB 2761—2017）規(guī)定的限量要求。

3 結(jié)論

本文建立了全自動(dòng)固相萃取-HPLC-FLD柱后衍生法測(cè)定糧食中黃曲霉毒素B1的方法。實(shí)驗(yàn)采用了穩(wěn)定性好的HPLC-FLD，同時(shí)結(jié)合全自動(dòng)固相萃取儀、全自動(dòng)平行濃縮儀、垂直振蕩儀等一系列自動(dòng)化設(shè)備替代人工操作，優(yōu)化了前處理的關(guān)鍵條件，同時(shí)考察了標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法檢出限和定量限、精密度和加標(biāo)回收率等。結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，有效避免了人工操作帶來的系統(tǒng)誤差，適合檢測(cè)大批量樣品，可以滿足糧食中黃曲霉毒素B1的測(cè)定要求。

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