龔敏　梁振綱　孫慧潔

摘 要 建立檳榔中9種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的三重四級(jí)桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，采用1%乙酸-乙腈溶液作為提取液，直接稀釋后以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下檢測(cè)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9種有機(jī)磷農(nóng)藥成分的線性范圍均在2～20 ng/mL，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。方法的平均回收率在73.4%～120%，RSD為0.59%～9.93%，方法檢出限為50.0 μg/kg。此方法具有良好的回收率及穩(wěn)定性，可用于檳榔中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 檳榔 ；有機(jī)磷農(nóng)藥 ；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號(hào) TS255.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.10.017

Abstract To establish a new method for analysis of residues of nine organophosphorus pesticides in Areca catechu Linn by using HPLC-MS-MS， one percent of acetic acid in acetonitrile was used as an extraction solvent for determination of organophosphorus pesticides by using HPLC-MS-MS. The results showed that the linear range of components of nine organophosphorus pesticides was 2～20 ng/mL with the correlation coefficient r being above 0.999. The average recovery was 73.4%～120%， and the RSD was 0.59%～9.93%. The limit of detection （LOD） was 50.0 μg/kg. This method had good stability and high recovery rate， and can be used to detect organophosphorus pesticide residues in Areca catechu Linn.

Keywords Areca catechu Linn ； organophosphorus pesticide ； HPLC-MS-MS

檳榔（Areca catechu Linn）是棕櫚科植物檳榔的種子，位列中國(guó)四大南藥之首[1]。味苦、性辛、溫，歸胃、大腸經(jīng)，有殺蟲(chóng)、破積、下氣、行水的功效[2]。具有驅(qū)蟲(chóng)[3-4]、鎮(zhèn)痛、消炎、抗氧化[5]、抗病原微生物、擬膽堿[6]等藥理作用。海南是中國(guó)檳榔的主要產(chǎn)區(qū)，主要是以鮮果或干果供應(yīng)檳榔加工企業(yè)生產(chǎn)檳榔嚼塊。然而2013年“檳榔致癌”風(fēng)波爆發(fā)以來(lái)，海南省檳榔產(chǎn)業(yè)受到嚴(yán)重影響。“檳榔致癌”風(fēng)波使人們更加關(guān)注檳榔的質(zhì)量安全、控制和檢測(cè)。

有機(jī)磷農(nóng)藥殘留是影響食用檳榔產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素之一，是檳榔產(chǎn)業(yè)鏈在種植、加工、保存環(huán)節(jié)中主要外源性有害物質(zhì)之一[7-8]。目前有機(jī)磷農(nóng)藥常用的檢測(cè)方式主要有氣相色譜法（GC）、氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）和液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS/MS）。有機(jī)磷農(nóng)藥易氣化，且氣相色譜穩(wěn)定性較好，被廣泛地用于有機(jī)磷農(nóng)殘的定量檢測(cè)中[9]。為減少干擾物質(zhì)的影響，通常將氣相色譜和質(zhì)譜儀聯(lián)用，可以更加準(zhǔn)確的定量和定性[10-11]。目前有機(jī)磷農(nóng)藥的定性定量檢測(cè)大部分采用的是氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用方法。但氣相色譜的缺點(diǎn)是分離時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)效率不高。而高效液相色譜可以對(duì)非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，與質(zhì)譜聯(lián)用后可以提高靈敏度，與二級(jí)質(zhì)譜的聯(lián)用還可對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行裂解，獲得豐富的結(jié)構(gòu)信息，具有高效率和良好的定性、定量能力[12]。隨著多殘留檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)越來(lái)越多地被應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域[13-14]。本文針對(duì)檳榔中常見(jiàn)的9種有機(jī)磷農(nóng)藥，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件，建立了檳榔中9種有機(jī)磷農(nóng)藥的定性、定量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

美國(guó)安捷倫公司Agilent 1200 超高效液相色譜儀、美國(guó)ABI 公司API 4000Q 四極桿質(zhì)譜儀、美國(guó)Varian公司Harvard Ⅱ針泵、廣州IKA公司MS3渦旋混勻器、5810R離心機(jī)、G-285 電子天平。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯、甲酸、乙酸、乙酸銨（色譜純級(jí)）、甲胺磷、敵百蟲(chóng)、伏殺硫磷、甲基嘧啶磷、速滅磷、殺撲磷、亞胺硫磷、治螟磷、三唑磷。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

有機(jī)磷農(nóng)藥類標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)物中心，濃度為100 μg/mL。分別準(zhǔn)確吸取各標(biāo)液0.1 mL加入100 mL容量瓶，乙酸乙酯定容，得到濃度為0.1 μg/mL的9種有機(jī)磷農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理

檳榔干果，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，剪碎其纖維，準(zhǔn)確稱取1.00 g（精確至0.01 g）至50 mL具塞離心管中，加入20 mL 1%乙酸-乙腈，渦旋震蕩5 min，加入2 g無(wú)水硫酸鈉，渦旋混合1 min，9 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液待測(cè)。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Thermo Accucore aQ 2.1×100 mm，2.6 μm，填料為C18；柱溫：40℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸梯度洗脫，洗脫條件見(jiàn)表1。

1.2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

離子源：電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）模式；離子源溫度600℃；離子源電壓5 500 V；霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮?dú)?，質(zhì)譜優(yōu)化條件見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)中常用的提取溶劑有丙酮、乙酸乙酯和乙腈，因乙酸乙酯不溶于水，不可以直接作為溶劑供液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)，所以提取溶劑優(yōu)先選擇丙酮和乙腈。丙酮作為提取溶劑時(shí)得到的提取液會(huì)含有更多的共萃物[15]，不易凈化，所以《食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的測(cè)定》（GB/T 2009.20-2003）和《植物源性食品中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多種殘留的測(cè)定》（GB/T 5009.145-2003）采用丙酮作為提取溶劑的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)均加入了繁雜的固相萃取凈化步驟。 而乙腈作為一種極性有機(jī)溶劑，其優(yōu)點(diǎn)是糖類、蛋白質(zhì)和大多數(shù)親脂性物質(zhì)不會(huì)被提取，滲透性強(qiáng)，對(duì)大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥具有良好的溶解性。本試驗(yàn)主要采用稀釋法降低基質(zhì)減弱效應(yīng)對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響，達(dá)到快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確性高的目的，選擇乙腈作為提取溶劑，并在乙腈中添加1%乙酸作為類分析保護(hù)劑。

2.2 凈化條件的選擇

本試驗(yàn)方法同時(shí)檢測(cè)了極性較大的有機(jī)磷農(nóng)藥品種，如甲胺磷、敵百蟲(chóng)和極性相對(duì)較小的品種，如甲基嘧啶磷等，其中甲胺磷和敵百蟲(chóng)等易降解，所以給凈化方式造成了一定難度。因考慮到實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)易降解農(nóng)藥回收率的影響，本試驗(yàn)分別考察了QuEChERS的前處理方法和直接稀釋法的凈化效果，結(jié)果表明QuEChERS中使用PSA對(duì)樣品凈化時(shí)在吸附了極性雜質(zhì)的同時(shí)對(duì)甲胺磷和敵百蟲(chóng)也有不同程度的吸附，而直接稀釋法雖然存在一定程度的雜質(zhì)干擾和基質(zhì)效應(yīng)，但是在色譜圖上顯示雜質(zhì)可與9種有機(jī)磷農(nóng)藥的保留時(shí)間完全分離。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

分別考察了水、0.1%甲酸水溶液、0.005 mol/L乙酸銨水溶液對(duì)峰形、響應(yīng)值等影響。結(jié)果表明：以甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)回收率和響應(yīng)值均不高；在對(duì)0.005 mol/L乙酸銨水溶液和0.1%甲酸水溶液進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.1%甲酸水溶液能讓峰形更尖銳，響應(yīng)值更高。因待測(cè)液溶劑為純乙腈，在色譜分離時(shí)有溶劑效應(yīng)的影響，峰形分叉，響應(yīng)值低，見(jiàn)圖1。在變換流動(dòng)相比例不能對(duì)峰形和響應(yīng)值達(dá)到優(yōu)化效果的情況下，本試驗(yàn)嘗試降低進(jìn)樣量，結(jié)果證明峰形均變得尖銳，響應(yīng)值增加，見(jiàn)圖2。

2.4 質(zhì)譜條件的確定

將9種有機(jī)磷農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)品采用針泵直接流動(dòng)注射進(jìn)樣，采用正離子模式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，確定待測(cè)物的分子離子峰， 確定了待測(cè)物的分子離子質(zhì)荷比后，通過(guò)碰撞氣將分子離子擊碎，碎片進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜分析，得到子離子的質(zhì)譜圖。通過(guò)多反應(yīng)離子檢測(cè)（MRM），選擇相對(duì)豐度較高的一組離子作為定量離子對(duì)，另一組作為定性離子對(duì)。同時(shí)對(duì)電噴霧電壓、霧化氣壓力、氣簾氣壓力、輔助氣流速、碰撞氣流速、離子源溫度、碰撞室出入口電壓和去簇電壓等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。詳見(jiàn)表2。

2.5 方法線性范圍、精密度和回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取0.1 μg/mL的9種有機(jī)磷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20、50、80、100、200 μL，分別用基質(zhì)提取液定容至1 mL，得到濃度為2、5、8、10、20 ng/mL的9中有機(jī)磷混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。依次進(jìn)樣，分別以峰面積Y為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的濃度值X為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以檳榔樣品作為基質(zhì)，分別對(duì)其添加低、中、高3個(gè)水平的9種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)樣，每個(gè)添加濃度做6個(gè)平行試驗(yàn)，用于考察本方法的回收率和精密度。結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，9種有機(jī)磷農(nóng)藥在2～20 ng/mL范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》（GB/T 27404-2008）中對(duì)校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)不低于0.99的要求。《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》（GB/T 27404-2008）規(guī)定，添加水平100 μg/kg時(shí)，回收率范圍應(yīng)在60%～120%，添加水平在100～1 000 μg/kg時(shí)，回收率范圍應(yīng)在80%～110%。添加水平在0.1 μg/kg～1 mg/kg時(shí)，變異系數(shù)范圍應(yīng)在43%～11%。由表3可知，結(jié)果符合檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求。

2.6 樣品檢測(cè)

對(duì)海南9個(gè)市售品牌的食用檳榔樣品進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)，9個(gè)樣品均未檢出有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。試驗(yàn)結(jié)果證明，試驗(yàn)所用食用檳榔樣品并未非法添加甲胺磷，因有機(jī)磷農(nóng)藥易降解，種植過(guò)程引入的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留可能經(jīng)過(guò)食用檳榔復(fù)雜的生產(chǎn)加工工序完全降解。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用直接稀釋法對(duì)檳榔樣品進(jìn)行前處理，樣品基質(zhì)提取液配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了食用檳榔中9種有機(jī)磷農(nóng)藥含量的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法。方法采用1%乙酸-乙腈作為提取液，提取液直接稀釋后供儀器檢測(cè)。以實(shí)際檢測(cè)時(shí)的信噪比（S/N）為3，計(jì)算本方法的檢出限為50.0 μg/kg。

結(jié)果表明，直接稀釋法是一種有效的樣品前處理方法。方法通過(guò)對(duì)提取液的稀釋，降低了干擾成分的濃度，提高待測(cè)組分離子化的競(jìng)爭(zhēng)力，減弱基質(zhì)效應(yīng)。同時(shí)，方法克服了不同品種有機(jī)磷農(nóng)藥因極性不同而無(wú)法同時(shí)采用吸附凈化劑的問(wèn)題，適用范圍更加廣泛。相較其它的農(nóng)殘分析方法，直接稀釋法具有節(jié)省溶劑、低檢測(cè)成本、操作簡(jiǎn)便、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。本研究方法提取液經(jīng)過(guò)稀釋，減小基質(zhì)減弱效應(yīng)，譜圖中雜質(zhì)峰均與待測(cè)組分峰分離。該分析方法操作簡(jiǎn)便，效率高，準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好，適用于食用檳榔中有機(jī)磷農(nóng)藥的含量測(cè)定。

參考文獻(xiàn)

[1] 張渝渝，楊大堅(jiān)，張 毅. 檳榔的化學(xué)及藥理研究概況[J]. 重慶中草藥研究，2014（1）：37-44.

[2] 陳 峰，劉 濤，李建軍，等. 檳榔的藥用價(jià)值[J]. 中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2014，14（2）：243-245.

[3] 田喜鳳，戴建軍，董 路，等. 檳榔南瓜子合劑對(duì)豬帶絳蟲(chóng)作用的超微結(jié)構(gòu)觀察[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)病防治雜志，2002，15（6）：363-364.

[4] 查傳龍. 檳榔厚樸等對(duì)肝吸蟲(chóng)作用的體外觀察[J]. 南京中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1990，6（4）：34.

[5] 蔣 志，陳其城，曹立幸，等. 檳榔及其活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志，2013，38（11）：1 684-1 687.

[6] 劉東林，王小瑩，楊 冰，等. 檳榔藥理毒理研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志，2013，38（14）：2 273-2 275.

[7] 陳良秋. 海南島檳榔主要病蟲(chóng)害的化學(xué)防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007（18）：74-75.

[8] 肖學(xué)成，裴漢杰，陳清秀，等. 湘潭市檳榔鹵水中有機(jī)磷農(nóng)藥含量的調(diào)查[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，1995，2（1）：31.

[9] 劉紅麗，蘇永恒，翟志雷，等. 蔬菜、水果中有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留同時(shí)測(cè)定的氣相色譜法研究[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（1）：8-9.

[10] 尹秀蓮，游慶紅，羅程文，等. 凝膠滲透色譜-氣質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定枸杞中7種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（11）：83-85.

[11] 王海鳳，王俊斌，劉海學(xué)，等. 氣質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定果蔬中多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留[J]. 食品與機(jī)械，2013，29（1）：92-94.

[12] 金力超，范玉明，侯曉蓉，等. 色譜聯(lián)用技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用特點(diǎn)和新趨勢(shì)[J]. 藥物分析雜志，2015，35（9）：1 520-1 527.

[13] 賈 偉，黃峻榕，凌 云，等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定茶葉中290種農(nóng)藥殘留組分[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2013，32（1）：9-22.

[14] 吳 巖，姜 冰，徐義剛，等. QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定果蔬中16 種農(nóng)藥殘留[J]. 色譜，2015，33（3）：228-234.

[15] 毛秀紅，郟征偉，陳 鈳，等. 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定中藥材中74種農(nóng)藥殘留量[C]. 廣州：中國(guó)藥學(xué)雜志島津杯第九屆全國(guó)藥物分析優(yōu)秀論文評(píng)選交流會(huì)論文集，2009：413-422.