鐘睿梓 張悅 黃曉珺

【摘要】 膽固醇結(jié)石作為膽囊結(jié)石中發(fā)生率最高的一種結(jié)石，其形成機(jī)制可能與膽固醇代謝相關(guān)。泛素化是一種能夠調(diào)控蛋白及蛋白底物，以及介導(dǎo)蛋白降解的蛋白修飾作用，對(duì)細(xì)胞具有重要的生理學(xué)作用，而去泛素化酶（DUBs）是一種去除泛素化以達(dá)到影響蛋白質(zhì)功能的酶，目前泛素特異性蛋白酶20（USP20）作為一種去泛素化酶，可以通過對(duì)脂代謝關(guān)鍵限速酶起到去泛素化作用而影響血中膽固醇的含量。本文主要對(duì)膽固醇結(jié)石的形成、DUBs及泛素特異性蛋白酶（USPs）與疾病的關(guān)聯(lián)進(jìn)行綜述，并探討USP20對(duì)膽固醇的影響及其與膽固醇結(jié)石之間可能存在的關(guān)聯(lián)。

【關(guān)鍵詞】 泛素化 去泛素化酶 泛素特異性蛋白酶20 膽囊結(jié)石 膽固醇結(jié)石

Deubiquitinating Enzyme USP20 and Cholesterol Stone/ZHONG Ruizi， ZHANG Yue， HUANG Xiaojun. //Medical Innovation of China， 2024， 21（02）： -183

[Abstract] Cholesterol stone is the most common type of gallstone， and its formation mechanism may be related to cholesterol metabolism. Ubiquitination is a kind of protein modification that can regulate proteins and protein substrates and mediate protein degradation， and has important physiological effects on cells. Deubiquitination enzyme is an enzyme that removes ubiquitination to affect protein function， currently， ubiquitin specific protease 20 （USP20）， as a deubiquitinating enzyme （DUBs）， can affect the content of cholesterol in blood by deubiquitinating key rate-limiting enzyme of lipid metabolism. In this paper， the formation of cholesterol stone， the relationship between DUBs and ubiquitin specific protease （USPs） and diseases were reviewed， and the influence of USP20 on cholesterol and its possible relationship with cholesterol stone were discussed.

[Key words] Ubiquitination Deubiquitylating enzyme USP20 Gallstone Cholesterol stone

First-author's address： Jinan University， Guangzhou 510632， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.02.041

膽囊結(jié)石在全球都是常見的多發(fā)病，其中美洲土著人是全球膽囊結(jié)石患病率最高的人群，在歐洲約有20%的成年人發(fā)病，而在中國不同地區(qū)，膽囊結(jié)石發(fā)病率在3%～11%。膽囊結(jié)石患病率會(huì)隨著年齡增長而上升，且女性的患病率比男性高[1-2]。在各類膽囊結(jié)石中，膽固醇結(jié)石占所有膽囊結(jié)石的80%～90%，因此研究膽固醇結(jié)石的成因?qū)︻A(yù)防及治療膽囊結(jié)石至關(guān)重要。膽固醇結(jié)石的主要成分是膽固醇，有研究發(fā)現(xiàn)膽固醇代謝的關(guān)鍵酶羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶與膽固醇結(jié)石的形成密切相關(guān)[3]。去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）家族可以通過降解抑制蛋白質(zhì)的泛素過程來影響不同類型的通路及蛋白功能，從而對(duì)不同的良惡性疾病產(chǎn)生影響。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在缺乏泛素特異性蛋白酶20（USP20）基因的小鼠體內(nèi)HMG-CoA還原酶的穩(wěn)定性降低，并證明了USP20可以通過影響HMG-CoA還原酶來調(diào)節(jié)膽固醇的合成[4]。本文將介紹膽固醇與膽固醇結(jié)石的關(guān)系、DUBs家族，闡述與膽固醇代謝相關(guān)的USP20對(duì)體內(nèi)膽固醇代謝的影響，并對(duì)USP20在膽固醇結(jié)石形成中的作用進(jìn)行展望。

1 膽固醇結(jié)石與膽固醇代謝

1.1 膽固醇結(jié)石發(fā)病機(jī)制概述

膽囊結(jié)石是位于膽囊內(nèi)不易溶解于膽汁的大小不一的結(jié)石，大致可以分為膽固醇結(jié)石、膽色素結(jié)石、混合結(jié)石。其中膽固醇結(jié)石是以膽固醇為主要成分的膽囊結(jié)石。膽汁是一種水溶液，其主要成分為膽鹽，占膽汁的67%，其余成分還包括22%的磷脂及4%的膽固醇，三者相互作用形成微泡及微膠粒溶解于膽汁中。正常情況下，三者處于平衡狀態(tài)，若膽固醇的含量過多或膽鹽及磷脂的含量過少，膽固醇的超飽和現(xiàn)象就會(huì)出現(xiàn)并隨著膽固醇析出形成膽固醇結(jié)晶，在黏蛋白等成核因素的作用下形成膽固醇結(jié)石[5-6]。此外，膽囊的收縮功能障礙、膽汁凝血纖溶功能、血中膽固醇代謝、逆向轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)體內(nèi)膽固醇的清除、促成核因子都對(duì)膽固醇結(jié)石的形成有不同程度的影響[7]。同時(shí)，雌激素、肥胖、糖尿病、腸道菌群等也與膽固醇結(jié)石形成有著密切關(guān)系[1，8]。在基因?qū)用嫔希话阏J(rèn)為存在六類與膽囊結(jié)石形成相關(guān)的基因[9]。第一類為肝臟脂類代謝酶，其中HMG-CoA還原酶的基因通過編碼膽固醇合成限速酶HMG-CoA還原酶來提高患者體內(nèi)HMG-CoA還原酶的mRNA水平，而CYP1A1基因可編碼限速酶膽固醇7α-羥化酶。第二類為脂蛋白受體及相關(guān)蛋白，例如低密度脂蛋白受體、B族Ⅰ型清道夫受體等相關(guān)編碼基因及其他載脂蛋白編碼基因。第三類為肝臟及腸道細(xì)胞內(nèi)脂類轉(zhuǎn)運(yùn)器。第四類為肝臟及腸道細(xì)胞膜脂類轉(zhuǎn)運(yùn)器。第五類為肝臟脂類調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，主要在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)控膽固醇的代謝。第六類為膽囊收縮素及相關(guān)受體和與結(jié)石形成密切相關(guān)的黏蛋白。六大類膽囊結(jié)石形成相關(guān)基因中，有五種相關(guān)基因與肝臟及肝細(xì)胞內(nèi)外的脂類合成、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，由此可以看出脂類合成、代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)在基因水平上對(duì)膽固醇結(jié)石形成起到重要作用。

1.2 膽固醇代謝/HMG-CoA還原酶影響膽固醇結(jié)石形成

在膽固醇結(jié)石最近的研究進(jìn)展中，有學(xué)者認(rèn)為肝臟膽固醇的高分泌與過飽和膽汁是膽固醇結(jié)石形成的重要因素[10]。膽固醇生物合成途徑存在3個(gè)關(guān)鍵角色，分別為作為膽固醇生物合成主轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（SREBP2），以及生物合成途徑中的兩個(gè)限速酶HMG-CoA還原酶和角鯊烯單加氧酶[11]。

有藥物層面研究發(fā)現(xiàn)作用于HMG-CoA還原酶遠(yuǎn)端的膽固醇生物合成抑制劑在膽結(jié)石易感C57L小鼠飼喂致石飼料后可以防止膽固醇結(jié)石的形成[12]。同時(shí)依折麥布通過有效減少腸道膽固醇吸收和膽汁膽固醇分泌來預(yù)防膽結(jié)石，并通過降低膽汁飽和度來保護(hù)膽汁的運(yùn)動(dòng)功能，并通過形成大量的不飽和膽汁促進(jìn)膽結(jié)石的溶解。此外，依折麥布顯著降低膽結(jié)石患者膽汁中的膽固醇飽和度和延緩膽固醇結(jié)晶，即在藥物層面可通過減少膽固醇合成或作用于HMG-CoA降低膽固醇結(jié)石的發(fā)生率[13]。在基因?qū)用?，有研究將HMG-CoA還原酶的短發(fā)夾RNA（shRNA）克隆到表達(dá)載體上，使shRNA在動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定持久地表達(dá)，從而持久抑制靶基因的mRNA表達(dá)[14]。而其中shRNA-3表達(dá)質(zhì)粒載體明顯抑制HMG-CoA還原酶的表達(dá)，且shRNA-3組的成石率明顯降低，說明在基因?qū)用嬉种艸MG-CoA還原酶的表達(dá)可有效抑制結(jié)石的形成。綜上可見HMG-CoA還原酶與結(jié)石形成關(guān)系密切。

2 DUBs的功能、組成及在疾病中的作用

2.1 泛素化與去泛素化

翻譯后修飾（PTM）是一種復(fù)雜的生物學(xué)功能調(diào)控機(jī)制，其對(duì)細(xì)胞培育、應(yīng)激反應(yīng)起到重要作用。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在翻譯后通常會(huì)受到如磷酸化、甲基化、乙?；胺核鼗阮愋偷男揎棧渲蟹核鼗?fù)責(zé)調(diào)控蛋白之間的相互作用、蛋白底物的酶激活及蛋白酶介導(dǎo)的蛋白降解。已有實(shí)驗(yàn)證明通過泛素化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解通路是維持真核細(xì)胞蛋白平衡的重要途徑之一[15]。因此蛋白泛素化修飾在多種生物學(xué)現(xiàn)象中起到重要的調(diào)節(jié)作用。作為一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過程，蛋白質(zhì)的泛素化修飾可以被特異的酶去除，其通過切斷泛素C末端尾部與目標(biāo)賴氨酸之間的異肽鍵，從而影響蛋白質(zhì)的功能，這一過程稱為去泛素化，而這種具有特殊功能的酶被稱為DUBs[16]。DUBs不僅可以通過不同泛素鏈接方式選擇性地切割底物蛋白的泛素部分，同時(shí)DUBs也可以根據(jù)本身不同類型的催化結(jié)構(gòu)域分為依賴氨基酸三聯(lián)體、結(jié)構(gòu)與半胱氨酸蛋白酶相似的泛素特異性蛋白酶（USPs）、泛素羧基末端水解酶（UCHs）、卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶（OTUs）、Josephins家族和依賴鋅的JAB1/MPN/MOV34金屬蛋白酶（JAMMs）家族[17-18]。同時(shí)近年來一種擁有獨(dú)特折疊方式的蛋白家族——Mindy家族被確認(rèn)為第六種DUBs的新成員[19]。

2.2 DUBs與疾病的關(guān)系

大多數(shù)DUBs不僅在正常的細(xì)胞中發(fā)揮作用，也被證明與多種疾病有關(guān)，包括癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和傳染病。去泛素化可以在酶、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、病毒蛋白、免疫反應(yīng)蛋白、許多細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)器及已知的癌基因或抑癌基因的表達(dá)產(chǎn)物上發(fā)揮作用。許多研究已經(jīng)表明DUBs也可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、蛋白激酶B（PKB）、核因子κB（NF-κB）和其他癌癥相關(guān)通路的調(diào)節(jié)，例如USP7的異常激活及USP4與結(jié)直腸癌相關(guān)，其中USP4能在許多類型的腫瘤中表達(dá)，被認(rèn)為是一個(gè)潛在的致癌基因。另外USP14的過度表達(dá)也能導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。雖然大部分DUBs能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，但也有一些DUBs可以起到抑制腫瘤的功能，如圓柱瘤蛋白（CYLD）可以通過作用于DVL底物來抑制多發(fā)性骨髓瘤的表達(dá)[16]。因此，以DUBs為方向的治療策略不僅具有廣泛的開發(fā)價(jià)值，也擁有著良好的開發(fā)前景。

3 USPs及USP20與疾病的關(guān)系

3.1 DUBs中最大的家族——USPs

在人體中USPs家族擁有56個(gè)蛋白酶成員，是DUBs六大家族中成員最大的家族[19]，可見USPs在人體中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。USPs還參與多種與生物過程相關(guān)的分子信號(hào)通路，包括DNA損傷修復(fù)、p53和TGF-β途徑。近年來USPs作為潛在的治療靶點(diǎn)引起了越來越多的關(guān)注。所有的USPs都包含一個(gè)保守的催化結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域會(huì)被一個(gè)或多個(gè)附加結(jié)構(gòu)域所包繞，例如與泛素相關(guān)的DUSP結(jié)構(gòu)域和N-末端鋅指泛素結(jié)構(gòu)域（ZnF-UBP）。USPs家族的功能障礙會(huì)導(dǎo)致癌癥、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性病變等疾病的發(fā)生與發(fā)展[20]。MDM2是一種與腫瘤抑制因子p53結(jié)合，促進(jìn)p53腫瘤抑制蛋白降解的泛素連接酶，USP17作為一種特異性的蛋白水解酶，可以通過同時(shí)穩(wěn)定p53和MDM2從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生。USP2a的過表達(dá)通過泛素化穩(wěn)定MDM2-p53從而抑制MDM2介導(dǎo)的p53泛素化，最終導(dǎo)致p53的降解從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[15]。PPP1CA是蛋白磷酸酶1三個(gè)亞基之一，其通過MAPK通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移，而過表達(dá)的USP11在結(jié)直腸癌中可以抑制PPP1CA的降解來促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。另外USP14作為酵母菌UBP6的同源基因，其活性在與蛋白酶體結(jié)合時(shí)增強(qiáng)，并反過來抑制整體蛋白酶的功能。目前在免疫組化分析中USP14在肺癌、食道癌、胰腺癌和乳腺癌上過度表達(dá)[21]。有研究發(fā)現(xiàn)敲除USP14基因會(huì)使AKT和ERK信號(hào)通路失活，而AKT誘導(dǎo)的磷酸化可以激活USP14來減弱蛋白質(zhì)的降解作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[22-23]。由此可以看出，USP家族與腫瘤進(jìn)展的機(jī)制有著重要的關(guān)聯(lián)及意義，為通過調(diào)節(jié)USPs家族來調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了重要的研究基礎(chǔ)。USPs家族不僅對(duì)癌癥的發(fā)生起到重要作用，在炎癥性腸病、肺纖維化等疾病中也能通過相關(guān)的信號(hào)通路對(duì)疾病的發(fā)生起到正性或負(fù)性的影響[24-25]。

3.2 疾病中的USP20

USP20作為USPs家族的一員，近年來發(fā)現(xiàn)其在腫瘤、脂質(zhì)代謝[4]和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中表現(xiàn)出新的生理作用，并因其在藥物開發(fā)與藥物治療中的潛力而受到越來越多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)USP20在結(jié)直腸癌中存在著高表達(dá)，同時(shí)高表達(dá)的還有β-catenin，USP20通過去泛素β-catenin使β-catenin在不被降解的情況下進(jìn)入細(xì)胞核，β-catenin與淋巴增強(qiáng)因子和T細(xì)胞因子結(jié)合，激活其基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)腫瘤的增殖與侵襲[26]。在乳腺癌中，USP20去泛素化轉(zhuǎn)錄抑制因子SNAI2來調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[27]。MCL1是抗凋亡B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）蛋白家族的重要成員，在細(xì)胞的增殖、分化中發(fā)揮著重要作用，在食管癌中USP20可以通過去泛素化穩(wěn)定MCL1在食管癌中穩(wěn)定表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥產(chǎn)生耐藥性[28]。USP20還可以通過穩(wěn)定相關(guān)基因組的信號(hào)通路及由于基因缺失導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的相關(guān)基因來抑制腫瘤的發(fā)生?？梢钥闯鯱SP20對(duì)于腫瘤存在促進(jìn)及抑制兩個(gè)方面的調(diào)控作用[29-30]。USP20的作用不僅限于腫瘤，在其他疾病中也存在相關(guān)的調(diào)控。在神經(jīng)炎癥中，USP20的過表達(dá)可以減弱神經(jīng)炎癥因子的表達(dá)及抑制NF-κB相關(guān)炎癥信號(hào)的增強(qiáng)通路從而緩解神經(jīng)炎癥反應(yīng)和減少神經(jīng)元的死亡，此外當(dāng)受到HSV-1感染時(shí)，USP20可以穩(wěn)定相關(guān)免疫介質(zhì)，免疫介質(zhì)通過激活下游炎癥通路促進(jìn)細(xì)胞抗病毒的反應(yīng)作用[31]。USP20還與代謝性疾病、心力衰竭等疾病的調(diào)控密切相關(guān)[32-33]，可以看出USP20在調(diào)控各類良惡性疾病的發(fā)生與發(fā)展中扮演著重要的角色。

3.3 USP20與膽固醇結(jié)石

HMG-CoA還原酶是膽固醇代謝中的關(guān)鍵酶，如前文所述，高脂血癥小鼠極易誘發(fā)膽固醇結(jié)石，發(fā)現(xiàn)在攝食狀態(tài)下，USP20可以穩(wěn)定膽固醇生物合成途徑中的限速酶HMG-CoA還原酶，餐后胰島素和葡萄糖濃度的增加可刺激mTORC1在S132和S134處磷酸化USP20，并使USP20與HMG-CoA還原酶結(jié)合達(dá)到抑制HMG-CoA還原酶降解的目的[4]。該研究還通過高營養(yǎng)飼料喂養(yǎng)肝臟特異性USP20缺失的小鼠與將USP20（S132A/S134A）基因敲入的小鼠，發(fā)現(xiàn)在USP20缺失小鼠中HMG-CoA還原酶的穩(wěn)定性較USP20基因敲入小鼠的穩(wěn)定性更低。另外，通過將小鼠禁食后向其腹膜注射葡萄糖或胰島素，檢測(cè)血中血糖及胰島素的變化，并利用胰島素信號(hào)通路中mTOR、ATK相關(guān)抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝臟中USP20的水平保持不變而HMG-CoA還原酶在葡萄糖和胰島素的協(xié)同作用下表達(dá)升高，同時(shí)在使用mTOR、ATK抑制劑后USP20介導(dǎo)的HMG-CoA還原酶存在累積上升的現(xiàn)象。USP20可能對(duì)mTORC1下游的胰島素和葡萄糖產(chǎn)生反應(yīng)。此外，該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)mTOCR1在再攝食導(dǎo)致高血糖的過程中還可以使S132和S134殘基上的USP20磷酸化。最后在USP20的特異性抑制劑作用于小鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該抑制劑不僅抑制了肝臟中USP20的表達(dá)，還導(dǎo)致HMG-CoA還原酶穩(wěn)定性降低，使肝臟、血清和脂肪組織中的脂質(zhì)水平降低。該研究揭示了一個(gè)由USP20磷酸化作用調(diào)控，從mTORC1到HMG-CoA還原酶的調(diào)節(jié)途徑，并表明USP20的抑制劑可以用來降低膽固醇水平，而且還可以通過產(chǎn)生琥珀酸來增加能量消耗。近年來人們逐漸發(fā)現(xiàn)，USP20對(duì)于膽固醇代謝的調(diào)控可以用于治療包括高脂血癥、肝脂肪變性、肥胖和糖尿病在內(nèi)的代謝性疾病[20]。由此我們可以看出，在以高膽固醇為基礎(chǔ)所致的膽囊結(jié)石（尤以膽固醇結(jié)石為主）的發(fā)病機(jī)制或許也受USP20的調(diào)控。

4 小結(jié)與展望

DUBs家族與各類疾病息息相關(guān)，作為DUBs家族中最大家族的一員，USP20通過與HMG-CoA相互作用來保持膽固醇合成途徑關(guān)鍵酶HMG-CoA還原酶的穩(wěn)定，并間接通過經(jīng)典途徑提高血中膽固醇含量，而血中膽固醇含量與膽固醇結(jié)石的形成存在直接關(guān)系，綜上我們可以合理推測(cè)DUBs家族中的USP20在調(diào)節(jié)膽固醇代謝方面與膽固醇結(jié)石的形成具有一定的相關(guān)性。但是目前有關(guān)USP20與膽固醇關(guān)系的研究僅停留在小鼠實(shí)驗(yàn)，且尚沒有實(shí)驗(yàn)表明USP20提高膽固醇含量與膽固醇結(jié)石的形成存在直接關(guān)聯(lián)，在DUBs家族與膽固醇結(jié)石形成方面國內(nèi)外還處于空白，我們希望有相關(guān)實(shí)驗(yàn)?zāi)芴钛a(bǔ)這一空白，探索USP20是否能成為下一個(gè)預(yù)防及治療膽固醇結(jié)石的重要靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2023-05-12） （本文編輯：陳韻）