李宵 王丹丹 馬巍 李兵 賈俊棟 王泰然 趙季紅

摘要 目的：研究達(dá)格列凈對(duì)載脂蛋白E基因敲除（ApoE^-/-）小鼠動(dòng)脈粥樣硬化（AS）斑塊的影響，探討其抗AS作用的可能機(jī)制。方法：16只8周齡雄性ApoE^-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)8周形成AS模型后，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只，實(shí)驗(yàn)組予達(dá)格列凈干預(yù)，對(duì)照組予同等劑量的生理鹽水，兩組干預(yù)4周后取材。油紅O染色檢測(cè)主動(dòng)脈及主動(dòng)脈瓣AS斑塊面積比例；流式細(xì)胞術(shù)分析循環(huán)中單核細(xì)胞亞群的比例（Ly6G-CD11b＋Ly6C^hi和 Ly6G-CD11b＋Ly6C^lo）；免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡成像檢測(cè)斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞和增殖的巨噬細(xì)胞（F4/80和Ki67雙陽(yáng)性細(xì)胞）；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較有降低主動(dòng)脈及主動(dòng)脈瓣斑塊負(fù)荷的作用，降低循環(huán)中Ly6C^hi單核細(xì)胞比例，降低斑塊內(nèi)增殖巨噬細(xì)胞比例，降低LDL-C水平，且具有升高HDL-C作用。結(jié)論：達(dá)格列凈可減輕ApoE^-/-小鼠AS負(fù)荷的作用，可能與調(diào)節(jié)單核細(xì)胞亞群和血脂代謝相關(guān)。

關(guān)鍵詞 動(dòng)脈粥樣硬化；達(dá)格列凈；單核細(xì)胞亞群；增殖巨噬細(xì)胞；血脂；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.03.012

基金項(xiàng)目 邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.21422083111）

作者單位 1.邯鄲市中心醫(yī)院（河北邯鄲056001），E-mail：lixiao130406@163.com；2.華北醫(yī)療健康集團(tuán)峰峰礦區(qū)總醫(yī)院；3.武警特色醫(yī)學(xué)中心/天津市心血管重塑與靶器官損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

引用信息 李宵，王丹丹，馬巍，等.達(dá)格列凈對(duì)ApoE^-/-小鼠單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)及動(dòng)脈粥樣硬化的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（3）：470-474.

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導(dǎo)致心血管疾病的主要病理生理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說(shuō)，包括脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、慢性炎癥學(xué)說(shuō)等^［1］，其特征是動(dòng)脈壁內(nèi)膜發(fā)生明顯的慢性炎癥反應(yīng)，而單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)參與了炎癥反應(yīng)的過(guò)程，在AS的進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用^［2］。達(dá)格列凈作為鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體2（sodium glucose co-transporters 2，SGLT2）抑制劑，是用于治療糖尿病相對(duì)新的一類抗高血糖藥物。國(guó)外一些臨床研究已經(jīng)證實(shí)，達(dá)格列凈可以降低糖尿病病人心血管疾病的發(fā)生率。有臨床研究也證實(shí)，達(dá)格列凈能夠通過(guò)降低核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白-3的活化，減少白細(xì)胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-18（interleukin 18，IL-18）等炎性因子的產(chǎn)生和釋放，發(fā)揮抗AS形成的功效^［3］，而單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的變化參與了炎癥反應(yīng)會(huì)直接影響動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展^［4］。因此，設(shè)想達(dá)格列凈是否能通過(guò)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)而影響動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。為了驗(yàn)證該假設(shè)，本研究通過(guò)給載脂蛋白E基因敲除（ApoE^-/-）小鼠喂食高脂飼料構(gòu)建AS模型，并觀察達(dá)格列凈對(duì)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)及AS的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

油紅O購(gòu)自Sigma公司，USA；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒購(gòu)自北京艾然生物有限公司；流式細(xì)胞儀（Cytomics FC 500，Beckman Coulter，USA）；熒光顯微鏡（ECLIPSE 80i，Nikon，Japan）；激光掃描共聚焦顯微鏡（TCS SP8，Leica，Germany）；冰凍切片機(jī)（CM7500，Leica，Germany）；抗CD11b-PE、抗Ly6G-PerCP/Cy5.5和抗Ly6C-FITC均購(gòu)自Biolegend公司，USA；抗F4/80、抗Ki67均購(gòu)自Abcam公司，USA；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、TRITC標(biāo)記山羊抗兔二抗均購(gòu)自ImmunoReagents公司，USA；Mounting medium with DAPI，購(gòu)自中杉金橋公司，中國(guó)；其余國(guó)產(chǎn)試劑均為分析純；高脂飼料及正常飼料購(gòu)自江蘇省南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

16只8周齡ApoE^-/-小鼠，雄性，體質(zhì)量22～25 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為 SCXK（京）2102-0001，實(shí)驗(yàn)前均經(jīng) DNA 檢測(cè)為純合子。

1.3 動(dòng)物模型的制備、標(biāo)本的采集和處理

將小鼠高脂飲食喂養(yǎng)8周形成AS后，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組喂食達(dá)格列凈劑量為1 mg/（kg·d），對(duì)照組給予同等劑量的生理鹽水。喂養(yǎng)4周后，麻醉并通過(guò)摘眼球取血，第1滴血用于檢測(cè)單核細(xì)胞亞群，剩余血液制備血清檢測(cè)總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的水平，留取主動(dòng)脈及主動(dòng)脈瓣進(jìn)行病理染色。本實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)、模型制備、標(biāo)本采集及處理均在天津市心血管重塑與靶器官損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.4 油紅O染色

主動(dòng)脈和主動(dòng)脈瓣進(jìn)行油紅O染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察主動(dòng)脈和主動(dòng)脈瓣的斑塊及斑塊負(fù)荷。具體方法參照本實(shí)驗(yàn)室前期研究^［5］，采用圖像分析軟件（Image Pro Plus，IPP）計(jì)算主動(dòng)脈斑塊的面積、主動(dòng)脈的面積、主動(dòng)脈瓣斑塊面積和血管橫斷面面積，主動(dòng)脈斑塊負(fù)荷＝主動(dòng)脈斑塊面積/主動(dòng)脈面積，主動(dòng)脈瓣斑塊負(fù)荷＝主動(dòng)脈瓣斑塊面積/血管橫斷面面積。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)循環(huán)Ly6G-CD11b＋Ly6C^hi單核細(xì)胞亞群比例

參照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行檢測(cè)^［5］，具體步驟：取100 μL抗凝全血加入 Ly6G-PerCP/Cy 5.5，Ly6C-FITC，CD11b-PE，cell staining buffer吹打混勻，室溫避光孵育15 min，加入600 μL紅細(xì)胞裂解液，上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)lowJo 7.6.1軟件分析流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。

1.6 免疫熒光染色

參照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行免疫熒光染色^［5］，將冷凍的主動(dòng)脈瓣切片于室溫解凍，1%的TritonX^-100破膜20 min，山羊血清封閉20 min，加入大鼠抗小鼠單抗F4/80（1∶100）和兔抗小鼠多抗Ki67（1∶300）4 ℃孵育過(guò)夜，次日加入山羊抗兔IgG，TRITC 和山羊抗大鼠Ig G，F(xiàn)ITC，室溫孵育1 h，含DAPI的防淬滅封片劑封片。巨噬細(xì)胞和增殖巨噬細(xì)胞密度計(jì)算如下，采用圖像分析軟件IPP計(jì)算熒光顯微鏡拍攝視野內(nèi)巨噬細(xì)胞和增殖巨噬細(xì)胞（F4/80和Ki67雙陽(yáng)性細(xì)胞）個(gè)數(shù)和斑塊面積，增殖巨噬細(xì)胞比例＝增殖巨噬細(xì)胞密度/巨噬細(xì)胞密度。

1.7 血清血脂水平測(cè)定

按照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法^［5］，取出血清復(fù)溫后，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，ELISA分析TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graph Pad Prism6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x^-±s）表示，組間比較采取獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組油紅O染色結(jié)果

主動(dòng)脈經(jīng)油紅O染色，紅色即為AS斑塊區(qū)域（見圖1），實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，主動(dòng)脈內(nèi)斑塊負(fù)荷量減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.150±0.007與 0.121±0.007，P＝0.010）。主動(dòng)脈瓣經(jīng)油紅O染色，紅色即為AS斑塊區(qū)域（見圖2）；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后提示，實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈瓣的斑塊負(fù)荷較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.329 9±0.009 0 與 0.270 0±0.012 5，P＝0.001 6）。詳見圖3。

2.2 循環(huán)中單核細(xì)胞亞群比值結(jié)果

循環(huán)中單核細(xì)胞亞群的設(shè)門策略詳見圖4，通過(guò) FlowJo 7.6.1 軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，循環(huán)中Ly6C^hi比例下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.3299±0.009 0 與 0.270 0±0.012 5，P＝0.001 6）。詳見圖5。

2.3 主動(dòng)脈瓣AS斑塊內(nèi)增殖巨噬細(xì)胞比例

主動(dòng)脈瓣經(jīng)免疫熒光染色后，通過(guò)激光共聚焦觀察，其中藍(lán)色為DAPI標(biāo)記細(xì)胞核所激發(fā)熒光，綠色為FITC標(biāo)記F4/80所激發(fā)熒光，紅色為TRITC標(biāo)記Ki67所激發(fā)熒光，結(jié)果所示DAPI和FITC雙陽(yáng)性表示巨噬細(xì)胞（藍(lán)色和綠色共存），DAPI、FITC和TRITC三色標(biāo)記同時(shí)在一個(gè)細(xì)胞則證明為增殖的巨噬細(xì)胞（粉色和綠色共存，見圖6）。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，斑塊內(nèi)增殖巨噬細(xì)胞比例下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.3500±0.022 4 與 0.273 8±0.024 6，P＝0.037 9）。詳見圖7。

2.4 小鼠血清中血脂比較

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，血清中TG水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（3.61±0.17）mmol/L與（0.29±0.22）mmol/L，P＝0.021］，HDL-C的水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（2.72±0.16）mmol/L與（3.15±0.13）mmol/L，P＝0.048］，但TC［（24.06±0.99）mmol/L與（23.16±0.95）mmol/L，P＝0.525］及LDL-C［（22.68±0.79）mmol/L與（21.10±1.11）mmol/L，P＝0.262］水平下降，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖8。

3 討 論

AS是心血管疾病、外周動(dòng)脈及腦血管疾病發(fā)病的基礎(chǔ)，動(dòng)脈血管內(nèi)皮下斑塊的形成導(dǎo)致血管腔明顯狹窄，引起組織缺血缺氧，大部分心肌梗死是由于AS斑塊破裂導(dǎo)致自發(fā)血栓形成阻塞血管引起的，這也是全球最常見的死因^［6］。AS的藥物治療非常有限主要是抗血小板聚集、調(diào)脂穩(wěn)斑、降低心肌耗氧量、抑制心室重塑，近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)格列凈可以降低大鼠心肌組織中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、單核細(xì)胞趨化因子-1（MCP-1）的水平，延緩心室重塑進(jìn)程^［7］；也有研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)格列凈可通過(guò)抑制炎性因子 IL-1β、IL-18 的產(chǎn)生和釋放，降低糖尿病ApoE^-/-小鼠主動(dòng)脈及主動(dòng)脈瓣區(qū)AS斑塊負(fù)荷^［3］，2021年《老年人慢性心力衰竭診治中國(guó)專家共識(shí)（2021）》中推薦SGLT-2抑制劑可有效降低心力衰竭病人死亡率，適用于美國(guó)紐約心臟病協(xié)會(huì)（NYHA） 心功能分級(jí)Ⅱ～Ⅳ級(jí)射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭（HFrEF）病人^［8］，達(dá)格列凈對(duì)心血管保護(hù)作用的證據(jù)越來(lái)越多。

本研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)格列凈可以降低主動(dòng)脈及主動(dòng)脈瓣斑塊的負(fù)荷，存在抑制AS進(jìn)程的作用。單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)可以影響AS的進(jìn)程，小鼠循環(huán)中單核細(xì)胞通過(guò)Ly6C的表達(dá)量不同可分為L(zhǎng)y6C^hi和Ly6C^lo兩種亞型，發(fā)揮不同的功能，健康小鼠的單核細(xì)胞中50%～60%為L(zhǎng)y6C^hi亞型，機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的狀態(tài)下，骨髓和脾臟中單核細(xì)胞的生成增加，使Ly6C^hi單核細(xì)胞亞型明顯升高，發(fā)揮抗炎作用^［9］。通過(guò)單核細(xì)胞亞群結(jié)果的柱狀圖，發(fā)現(xiàn)達(dá)格列凈可降低Ly6C^hi亞型的比例，抑制炎癥反應(yīng)。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為單核細(xì)胞通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)局部組織分化為巨噬細(xì)胞，但是近些年有研究證實(shí)了巨噬細(xì)胞在局部有增殖的現(xiàn)象，并且增殖巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用^［10］，具體機(jī)制可能是平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌的巨噬細(xì)胞集落刺激因子刺激局部巨噬細(xì)胞的自我增殖^［11］。本課題組前期研究通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)證明了斑塊內(nèi)增殖巨噬細(xì)胞的存在^［12］，提示達(dá)格列凈存在降低主動(dòng)脈瓣斑塊內(nèi)增殖巨噬細(xì)胞比例的作用，存在抑制AS的進(jìn)程。由此分析，達(dá)格列凈可能通過(guò)調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)揮抑制AS進(jìn)展的作用。

脂質(zhì)代謝紊亂是AS的主要危險(xiǎn)因素，目前文獻(xiàn)報(bào)道SGLT2抑制劑對(duì)血脂譜的影響尚無(wú)定論，但多為改善或中性結(jié)局，也有研究表明可升高LDL-C水平，但具體機(jī)制目前尚未明確^［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，在達(dá)格列凈有降低TG和升高HDL-C水平的作用，說(shuō)明達(dá)格列凈有調(diào)節(jié)血脂代謝的作用，這也可能是其發(fā)揮抗AS作用的潛在機(jī)制。

綜上所述，達(dá)格列凈可能通過(guò)影響單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)及血脂代謝發(fā)揮抗AS的作用，為AS的治療提供了新的思路，但具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

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（收稿日期：2022-04-12）

（本文編輯 王雅潔）