路麗 張洪坤 黃玉瑤 郝建新 仲勇成 王利勝 董翼虎 高貫彪

【摘?要】?目的：建立HPLC法測(cè)定參梅養(yǎng)胃顆粒（無蔗糖）中羥基紅花黃色素A的含量。方法：采用色譜柱ODS-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）為流動(dòng)相等度洗脫；檢測(cè)波長403 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min。結(jié)果：羥基紅花黃色素A在0.0480 ～0.7196 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率（n=9）為101.74%， RSD值為1.6%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，可以作為參梅養(yǎng)胃顆粒（無蔗糖）中羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定方法。

【關(guān)鍵詞】?參梅養(yǎng)胃顆粒（無蔗糖）；羥基紅花黃色素A；含量測(cè)定；HPLC法

【中圖分類號(hào)】R284.1???【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A????【文章編號(hào)】1007-8517（2024）03-0041-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.03.zgmzmjyyzz202403010

Determination of Hydroxysafflower Yellow A in Shenmei Yangwei Granules （Without Sucrose） by HPLC

LU Li1，2?ZHANG Hongkun1，2*?HUANG Yuyao1?HAO Jianxin3?ZHONG Yongcheng1

WANG Lisheng4?DONG Yihu5?GAO Guanbiao2

1. Sichuan Haoyun Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangyuan 628017，China;

2.Bozhou Huqiao pharmaceutical industy limited company，Bozhou 236800， China;

3.Guangzhou Heyi Medical Technology Co.， Ltd.， Guangzhou 510970，China;

4.Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006，China;

5.Guangyuan Drug Inspection and Testing Center， Guangyuan 628017，China

Abstract：Objective To establish an HPLC method for the determination of hydroxysafflower yellow A in Shenmei Yangwei granules （without sucrose）.Methods Chromatographic column ODS-C₁₈ （4.6mm × 250mm，5 μm）， elute with methanol-acetonitrile-0.7% phosphoric acid solution （26：2：72） as the flow equivalent， detection wavelength： 403 nm，column temperature 25℃，injection volume 10 μL， the flow rate is 1.0 mL/min.Results Hydroxysafflower yellow A was 0.0480-0.7196 μg the linear relationship within the range of is good， the average recovery rate（n=9） is 101.74%， and the RSD value is 1.6%.Conclusion The method is simple， accurate， reproducible and stable. It can be used for the determination of hydroxysafflower yellow A in Shenmei Yangwei granules （without sucrose）.

Keywords：Shenmei Yangwei Granules （Without Sucrose）;Hydroxysafflower Yellow A;Content Determination;HPLC

參梅養(yǎng)胃顆粒（無蔗糖）由北沙參、山楂、烏梅、紅花、丹參等十一味中藥組成，具有養(yǎng)陰和胃之功效。臨床用于胃痛灼熱、嘈雜似饑、口咽干燥、大便干結(jié)、淺表性胃炎、胃陰不足型慢性胃炎及各種胃部不適癥^［1］。方中北沙參、烏梅養(yǎng)陰生津止渴為君藥；蒲公英清熱解毒，紅花、丹參、莪術(shù)、當(dāng)歸活血化瘀、涼血止痛、潤腸通便為臣藥；白芍、甘草養(yǎng)陰柔肝緩急止痛為佐；山楂、土木香健脾消食、行氣止痛為使，諸藥合用，共奏養(yǎng)陰和胃活血止痛之功，且治療效果明顯，值得臨床推廣使用。

現(xiàn)行參梅養(yǎng)胃顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有理化鑒別項(xiàng)，無含量測(cè)定項(xiàng)目，無法有效控制藥物的內(nèi)在質(zhì)量^［2］。有研究者^［5-9］測(cè)定參梅養(yǎng)胃顆粒中的芍藥苷、丹酚酸B、甘草苷和甘草酸銨等指標(biāo)的含量，但是尚未有報(bào)道其中有效成分羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定研究。紅花為方中臣藥，具有活血化瘀、涼血止痛之功效，羥基紅花黃色素A為其主要藥效成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用^［3-4］。筆者通過一系列的實(shí)驗(yàn)研究，首次運(yùn)用HPLC法制定了參梅養(yǎng)胃顆粒（無蔗糖）中羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定方法。

1?儀器與材料

1.1?儀器?安捷倫1260液相色譜系統(tǒng)；BP211D電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，d=0.1 mg）；JM-2CD-40液晶單頻超聲波清洗儀器（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；AXTG16B醫(yī)用離心機(jī)（鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2?試藥?羥甲基紅花黃色素A（批號(hào)：111637-202111，含量96.8%，中國食品藥品檢定研究院）甲醇（色譜純，Merck）；乙腈（色譜純，Merck）；水為超純水，其它試劑為分析純。

樣品： 北沙參 （批號(hào)220201）、 山楂 （批號(hào)220201）、 烏梅 （批號(hào)220301）、莪術(shù)（批號(hào)220201）、土木香（批號(hào)220201）、蒲公英（批號(hào)220201）、丹參（批號(hào)220301）、甘草（批號(hào)220302）、白芍（批號(hào)220201）、當(dāng)歸（批號(hào)220301）均購于四川省泓圃藥業(yè)有限公司，上述藥材均經(jīng)四川豪運(yùn)藥業(yè)股份有限公司張洪坤副主任中藥師鑒定為正品。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件?色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，ODS-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；檢測(cè)波長：403 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min。理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2?對(duì)照品溶液的制備?取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，精密稱定，加25%甲醇制成每1 mL含0.125 mg的溶液，即得。

2.3?供試品溶液的制備?取本品約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 25%甲醇 50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率 480 W，頻率40 kHz）40 min，取出，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心（10000 r/min）10 min，取上清液，即得。

2.4?方法學(xué)考察

2.4.1?專屬性

2.4.1.1?溶劑空白溶液制備?25%甲醇溶液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.1.2?陰性樣品溶液制備（空白溶液）?取樣品約2 g（除紅花），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 25%甲醇 50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率 480 W，頻率40 kHz）40 min，取出，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心（10000 r/min）10 min，取上清液，即得。

2.4.1.3?輔料空白溶液的制備?取本品的輔料（糊精）2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 25%甲醇 50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率 480 W，頻率40 kHz）40 min，取出，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心（10000 r/min）10 min，取上清液，即得。

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、溶劑空白溶液、陰性樣品溶液及輔料空白溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果空白溶液及陰性樣品均無干擾，表明方法專屬性良好。如圖1所示。

2.4.2?線性關(guān)系考察?對(duì)照品工作曲線溶液：分別移取“2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.2 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加25%甲醇至刻度，搖勻，即得濃度為每1 mL含羥基紅花黃色素A 5 μg、12.5 μg、25 μg、40 μg、50 μg、75 μg、100 μg以及母液125 μg的系列對(duì)照品溶液。

精密吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，每個(gè)樣品測(cè)定3次；最后以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)對(duì)被測(cè)物的濃度函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.0349X-0.0113（R²=1）。結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A濃度在0.0480～0.7196 μg范圍內(nèi)，與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.3?精密度試驗(yàn)?取“2.4.2”項(xiàng)下25 μg/mL濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，記錄羥基紅花黃色素A的峰面積，結(jié)果峰面積RSD值為0.4%，說明儀器精密度良好。

2.4.4?重復(fù)性試驗(yàn)?取同一批樣品6份，每份約2 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定其峰面積。計(jì)算6份樣品的平均含量為0.48 mg/g，RSD值為0.5%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.5?加樣回收率試驗(yàn)?取已知羥基紅花黃色素A含量的樣品約1 g，共9份，每3份為一組，共3組，每組加入羥基紅花黃色素A對(duì)照品，加入量與所取供試品（1g樣品）中待測(cè)定成分量之比分別為（1.5∶1）、（1∶1）、（0.5∶1），按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液的方法制備9份供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。計(jì)算平均回收率為101.74%， RSD值為1.6%。結(jié)果符合相應(yīng)濃度下的準(zhǔn)確度的要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.4.6?檢測(cè)限和定量限?配制一系列低濃度的對(duì)照品溶液，分別為0.0999 μg/mL、 0.1998 μg/mL、0.2997 μg/mL、 0.3996 μg/mL、 0.4496 μg/mL、0.4995 μg/mL。精密吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定；記錄峰高值。以樣品峰高高度明顯大于2～3倍溶劑空白樣品基線高度的相應(yīng)濃度（或）量作為檢出限，以10倍以上空白樣品噪音基線高度的相應(yīng)量為定量限。結(jié)果顯示，檢測(cè)限為0.000999 μg，定量限為0.004496 μg。

2.4.7?穩(wěn)定性試驗(yàn)?取同一份供試品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h進(jìn)樣分析，考察供試品溶液穩(wěn)定性。結(jié)果，供試品溶液0～24 h測(cè)定的羥基紅花黃色素A色譜峰面積RSD為2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8?耐用性考察?對(duì)不同色譜柱、不同柱溫、不同流速、不同檢測(cè)波長及不同濃度流動(dòng)相進(jìn)行分析考察含量測(cè)定方法耐用性。結(jié)果顯示各考察因素下的目標(biāo)峰分離度、對(duì)稱因子、靈敏度、理論塔板數(shù)等均符合要求，且不同考察因素下測(cè)定羥基紅花黃色素A含量的RSD分別為2.0%、2.3%、3.2%、1.2%、1.2%，表明該含量測(cè)定方法的耐用性良好。結(jié)果見表2。

2.5?含量測(cè)定?取不同來源和批次的參梅養(yǎng)胃顆粒（無蔗糖），按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品中羥基紅花黃色素A的含量。結(jié)果見表3。

3?討論

3.1?供試品溶液的制備?在參梅養(yǎng)胃顆粒（無蔗糖）供試品溶液的制備中，以羥基紅花黃色素A的含量為指標(biāo)，系統(tǒng)考察了提取溶劑（水、25%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇）、提取方式（超聲、回流、冷浸）、提取次數(shù)（超聲處理1次、2次、3次）和時(shí)間（40 min、50 min、60 min）對(duì)提取率的影響，測(cè)定結(jié)果顯示，采用25%甲醇 50 mL超聲處理（功率 480 W，頻率 40 kHz）40 min的方法，提取效率較高，同時(shí)提取時(shí)間較短，且方法操作簡(jiǎn)便，故選用此制備方法。

3.2?檢測(cè)波長的選擇?在190～600 nm的紫外區(qū)進(jìn)行在線檢測(cè)，羥基紅花黃色素A在403 nm處有最大吸收，峰純度因子996，因此選擇403 nm作為參梅養(yǎng)胃顆粒（無蔗糖）中羥基紅花黃色素A指標(biāo)成分含量測(cè)定的檢測(cè)波長。

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法測(cè)定參梅養(yǎng)胃顆粒（無蔗糖）的羥基紅花黃色素A的含量，該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、耐用性好，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，可以作為參梅養(yǎng)胃顆粒（無蔗糖）的羥基紅花黃色素A含量的測(cè)定方法。由含量測(cè)定結(jié)果可知，自制樣品的羥基紅花黃色素A含量為2.65～3.15 mg/袋，市售樣品中的羥基紅花黃色素A含量為0.00～0.03 mg/袋，兩者含量存在顯著差異，考慮跟生產(chǎn)工藝以及羥基紅花黃色素A的穩(wěn)定性差有關(guān)。在參梅養(yǎng)胃顆粒（無蔗糖）的生產(chǎn)過程中涉及加熱提取濃縮等步驟，此過程會(huì)導(dǎo)致羥基紅花黃色素A產(chǎn)生一定的分解從而影響其含量。有研究^［10-12］表明光照、溫度、濕度等對(duì)羥基紅花黃色素A的穩(wěn)定性影響比較大，當(dāng)溫度高于60 ℃，加熱一定時(shí)間后，羥基紅花黃色素A就會(huì)發(fā)生水解；在避光條件下，羥基紅花黃色素A有較好的穩(wěn)定性。所以在參梅養(yǎng)胃顆粒（無蔗糖）的生產(chǎn)過程中需要特別注意生產(chǎn)工藝過程中加熱提取的溫度等參數(shù)對(duì)其含量的影響，同時(shí)對(duì)原料的質(zhì)量把控也是至關(guān)重要的。

考慮參梅養(yǎng)胃顆粒的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有理化鑒別項(xiàng)，無含量測(cè)定項(xiàng)目，無法有效控制藥物的內(nèi)在質(zhì)量，所以質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高迫在眉睫，建立有效成分的含量測(cè)定指標(biāo)有助于控制產(chǎn)品質(zhì)量，由此可見對(duì)參梅養(yǎng)胃顆粒（無蔗糖）中羥基紅花黃色素A的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立具有重要意義。

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（收稿日期：2023-05-05?編輯：陶希睿）

作者簡(jiǎn)介：路麗（1990—），女，漢族，碩士，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴幯邪l(fā)及其質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。E-mail：754513018@qq.com

通信作者：張洪坤（1986—），男，漢族，碩士，副主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴幯邪l(fā)及其質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。E-mail：hennanji@yeah.net