金國(guó)鈺，楊春潤(rùn)，何靜，蓋敏雪，張舒榮，劉歡歡，李長(zhǎng)忠

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355； 2. 山東省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250021； 3. 山東大學(xué)，山東 濟(jì)南 250012； 4. 濟(jì)南大學(xué)，山東 濟(jì)南 250024； 5. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330025； 6. 北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036）

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是一種常見的自發(fā)性和異質(zhì)性疾病，指女性40歲之前出現(xiàn)卵巢功能衰退甚至喪失，伴促性腺激素水平升高以及雌激素水平下降［1-3］。隨著醫(yī)療水平的發(fā)展以及就醫(yī)觀念的改變，POI 的發(fā)病率逐年增加且呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)［4-5］。多數(shù)POI 患者在月經(jīng)不調(diào)開始后12～24 個(gè)月內(nèi)卵巢功能迅速下降，隨之出現(xiàn)繼發(fā)性閉經(jīng)。同時(shí)，POI 還會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病及情志障礙相關(guān)疾?。ń箲]、抑郁）等，嚴(yán)重影響廣大女性身心健康［6-7］。

目前，POI 相關(guān)機(jī)制尚未完全明確，遺傳缺陷、自身免疫性疾病、醫(yī)源性因素和環(huán)境暴露等因素均能導(dǎo)致POI 的發(fā)生［8-9］。 激素替代療法（hormone replacement therapy，HRT）作為目前最常用的治療手段［6，10］，雖然能夠暫緩POI 帶來的一系列癥狀，但對(duì)生殖功能無明顯改善，同時(shí)長(zhǎng)期口服雌/孕激素也會(huì)增加靜脈血栓、中風(fēng)、婦科腫瘤等疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)［11-12］。

中醫(yī)學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)中尚無POI 的病名記載，可將其歸于“閉經(jīng)”“月經(jīng)后期”“血枯”“不孕癥”等范疇。目前，中醫(yī)藥在調(diào)經(jīng)促孕方面療效明顯，優(yōu)勢(shì)突出［13-15］，益腎調(diào)經(jīng)方作為臨床經(jīng)驗(yàn)方，能夠有效改善卵巢功能，保護(hù)女性生育能力，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究通過腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液（cyclophosphamide，CTX）構(gòu)建POI 模型大鼠，探討益腎調(diào)經(jīng)湯對(duì)CTX 誘導(dǎo)POI模型大鼠的影響及可能機(jī)制，以期為POI的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60 只SD 大鼠由山東省立醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，雌性，6 周齡，體質(zhì)量（220 ± 10）g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于山東省立醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心二樓東側(cè)SPF 環(huán)境中，室溫控制在20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守山東省立醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定（山東省立醫(yī)院動(dòng)物倫理批號(hào)為NO.2020-004）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

戊酸雌二醇片（1 mg/片，拜耳，批號(hào)：224A2）；益腎調(diào)經(jīng)方組方熟地黃15 g，當(dāng)歸12 g，醋龜甲10 g，山藥20 g，山茱萸12 g，酒蓯蓉20 g，醋香附15 g，黨參15 g，丹參15 g，黃芪20 g，枸杞子20 g，淫羊藿15 g，菟絲子20 g，由山東省立醫(yī)院藥房提供，益腎調(diào)經(jīng)方生藥與顆粒劑等量換算，相當(dāng)于免煎顆粒43.5 g/劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

4%組織細(xì)胞固定液、1 × PBS 緩沖液、蘇木素伊紅染色試劑盒（P1110、P1020、G1120，北京索萊寶科技有限公司）；環(huán)磷酰胺試劑（HY-17420，MCE）；大鼠雌二醇（E2）Elisa 試劑盒、大鼠促卵泡生長(zhǎng)激素（FSH）試劑盒、大鼠促黃體生成（LH）試劑盒、大鼠抗繆勒管激素（AMH）試劑盒（202206、202207、202207、202207，山東科研云生物科技公司）；兔抗PI3K 單克隆抗體、兔抗Akt 單克隆抗體、兔抗Bcl-2 單克隆抗體、鼠抗Bax 單克隆抗體（20584-1-AP、10176-2-AP、26593-1-AP、50599-2-Ig，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；RNA Isolater、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（017E2250FA、017E2250FA、027E2201CB，南京諾唯贊生物科技有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

微量電子秤（BS210S，德國(guó)Sartorious，）；室溫離心機(jī)（5430R，德國(guó)Eppendorf）；高速低溫離心機(jī)（5810R，德國(guó)Eppendorf）；組織脫水機(jī)（Excelsior AS，美國(guó)Thermo Scientific）；組織包埋機(jī)（Histostar，美國(guó)Thermo Scientific）；石蠟切片機(jī)（RM2235，德國(guó)Laica）；水平脫色搖床（TS-10000，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Multiskan FC，美國(guó)Thermo Scientific）；熒光定量PCR儀（LightCycler 480 Ⅱ，德國(guó)Roche）。

2 方法

2.1 模型建立和分組

SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，每天固定時(shí)間行陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查，連續(xù)10 d。將動(dòng)情周期正常的大鼠納入實(shí)驗(yàn)（n= 60），使用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為空白組、模型組、對(duì)照組和中藥低、中、高劑量組，每組10 只。空白組大鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組大鼠腹腔注射CTX 誘導(dǎo)POI 大鼠模型，首次50 mg/（kg·d），然后按8 mg/（kg·d）劑量連續(xù)給藥14 d。建模成功后，對(duì)照組給予0.1 mg/（kg·d）戊酸雌二醇；中藥各劑量組給予5 mL/（kg·d）的益腎調(diào)經(jīng)湯中藥溶液；空白組與模型組給予同等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃14 d。

參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》：200 g 大鼠的用藥劑量 =人臨床日用量 × 0.018 × 5。換算各組大鼠給藥濃度，結(jié)果見表1。

表1 各組給藥劑量及濃度

2.2 標(biāo)本采集

末次給藥后，禁食禁水12 h，腹腔注射25 mg/kg 戊巴比妥溶液用于麻醉大鼠，電動(dòng)剃毛器備皮，1%碘酊消毒，腹部行Y型切口，充分暴露腹主動(dòng)脈。使用一次性真空釆血管采血，室溫靜置45 min，離心15 min（離心條件：溫度4 ℃，1 500 r/min），上層淡黃色血清分裝于凍存管中，放于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。游離雙側(cè)卵巢、盡可能去除多余脂肪組織，稱重，一側(cè)卵巢放入液氮凍存，另一側(cè)卵巢4%的多聚甲醛固定。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 一般情況

從給藥第2 天開始，每天固定時(shí)間觀察并記錄大鼠的一般情況（體質(zhì)量、行為活動(dòng)、飲食、二便情況）。

2.3.2 動(dòng)情周期變化

從給藥第2 天開始，每天固定時(shí)間進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，連續(xù)14 d。

2.3.3 卵巢指數(shù)

游離雙側(cè)卵巢、盡可能去除多余脂肪組織，稱重并記錄，計(jì)算卵巢指數(shù)。

卵巢指數(shù) = 卵巢濕重（mg）/體質(zhì)量（g）

2.3.4 HE染色觀察卵巢組織形態(tài)改變組織切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化，伊紅染色，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。

2.3.5 ELISA法檢測(cè)血清激素水平

取大鼠血清，按照試劑盒說明書操作，檢測(cè)血清中E2、FSH、LH、AMH 含量，用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，算出各樣品的濃度。

2.3.6 RT-qPCR 檢測(cè)大鼠卵巢組織PI3K、Akt、Bcl-2及Bax表達(dá)

取部分卵巢組織，按照試劑盒說明書步驟操作，檢測(cè)PI3K、Akt、Bcl-2及Bax mRNA 表達(dá)情況，以2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，引物序列見表2。

表2 引物序列表

2.3.7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠卵巢組織PI3K、Akt、Bcl-2及Bax表達(dá)情況

組織切片脫蠟至水，Tris-EDT 修復(fù)液抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，5% BSA 封閉非特異性靶點(diǎn)，分別加入稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫，滴加適量即用型HRP 標(biāo)記抗兔二抗，DAB 顯色，滴加適量1% CuSO4增強(qiáng)信號(hào)，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片?？瞻捉M滴加PBS代替一抗，其余步驟同前。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

釆用SPSS25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本研究所使用數(shù)據(jù)均為計(jì)量數(shù)據(jù)，釆用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)間比較釆用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩數(shù)據(jù)間比較釆用LSD-t分析。P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況比較

空白組大鼠精神狀態(tài)良好，行為活動(dòng)正常，飲食及二便均正常。與空白組比較，模型組大鼠精神狀態(tài)差，活動(dòng)量減少，喜聚堆蜷臥，進(jìn)食減少，部分大鼠出現(xiàn)脫毛。給予對(duì)應(yīng)藥物治療后，上述癥狀出現(xiàn)不同程度改善，其中藥高劑量組、對(duì)照組效果最為明顯。

與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯下降（P＜ 0.000 1）；與模型組比較，給予治療藥物7 d后，對(duì)照組、中藥中劑量組及中藥高劑量組大鼠體質(zhì)量明顯增長(zhǎng)（P＜ 0.000 1），給予治療藥物14 d 后，各給藥組大鼠體質(zhì)量均有所增長(zhǎng)（P＜ 0.05）。其中，對(duì)照組及中藥高劑量組改善效果最為明顯，接近于空白組，且兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表3。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量變化情況比較（±s，g）

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量變化情況比較（±s，g）

注：與空白組比較，####P ＜ 0.000 1；與模型組比較，*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1；與對(duì)照組比較，△P ＜ 0.05，△△△△P ＜ 0.000 1。

第14天259.00 ± 1.53 224.70 ± 0.67####252.30 ± 1.76****215.70 ± 3.28*△△△△242.30 ± 0.88***△255.00 ± 1.73****組別空白組模型組對(duì)照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10第1天222.00 ± 1.52 223.70 ± 2.84 223.00 ± 2.30 219.30 ± 1.86 223.00 ± 2.30 222.70 ± 0.89第7天243.70 ± 2.03 210.30 ± 0.89####241.00 ± 1.16****210.30 ± 1.45△△△△233.70 ± 2.33****△245.70 ± 0.67****

3.2 各組大鼠動(dòng)情周期變化情況比較

與空白組比較，模型組大鼠動(dòng)情周期明顯延長(zhǎng)（P＜ 0.000 1）；與模型組比較，各給藥組大鼠動(dòng)情周期明顯縮短（P＜ 0.000 1）。見表4。

表4 各組大鼠動(dòng)情周期變化情況比較（±s）

表4 各組大鼠動(dòng)情周期變化情況比較（±s）

注：與空白組比較，####P ＜ 0.000 1；與模型組比較，****P ＜ 0.000 1；與對(duì)照組比較，△P ＜ 0.05。

動(dòng)情周期/h 113.30 ± 1.48 298.80 ± 8.53####133.80 ± 1.38****101.4 ± 4.20****△114.20 ± 1.16****137.20 ± 1.86****組別空白組模型組對(duì)照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10

3.3 各組大鼠卵巢指數(shù)情況比較

與空白組比較，模型組卵巢指數(shù)明顯下降（P＜0.000 1）；與模型組比較，對(duì)照組、中藥高劑量組卵巢指數(shù)明顯升高（P＜ 0.000 1），兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表5。

表5 各組大鼠卵巢指數(shù)情況比較（±s）

表5 各組大鼠卵巢指數(shù)情況比較（±s）

注：與空白組比較，####P ＜ 0.000 1；與模型組比較，****P ＜ 0.000 1；與對(duì)照組比較，△△△△P ＜ 0.000 1。

卵巢指數(shù)/%0.91 ± 0.08 0.37 ± 0.08####0.80 ± 0.06****0.28 ± 0.01△△△△0.37 ± 0.04△△△△0.80 ± 0.03****組別空白組模型組對(duì)照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10

3.4 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察

空白組卵巢組織皮質(zhì)及髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰完整，可見各級(jí)卵泡（始基、初級(jí)、次級(jí)卵泡和竇前卵泡等）及黃體，間質(zhì)內(nèi)血管豐富、未見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化。模型組卵巢組織結(jié)構(gòu)紊亂，卵巢髓質(zhì)萎縮，皮質(zhì)增生并出現(xiàn)纖維化樣改變，各級(jí)卵泡數(shù)量減少（始基卵泡、初級(jí)卵泡最為明顯），閉鎖卵泡數(shù)量增加。

給予相應(yīng)藥物后，中藥低劑量組無明顯改善，可見成熟卵泡，但整體數(shù)量較少；中藥中劑量組優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)目明顯增加，閉鎖卵泡減少；對(duì)照組、中藥高劑量組卵巢組織結(jié)構(gòu)清晰，各級(jí)卵泡數(shù)量較模型組、中藥低劑量組明顯增加，卵泡充盈，與空白組接近。見圖1。

圖1 卵巢組織病理切片圖（ × 200）

3.5 各組大鼠血清性激素水平比較

與空白組比較，模型組E2、AMH 水平下降（P＜0.001，P＜ 0.000 1）、FSH、LH水平升高（P＜ 0.000 1）；與模型組比較，各給藥組E2水平升高（P＜ 0.000 1）、FSH、LH 水平降低（P＜ 0.01，P＜ 0.001，P＜0.000 1），對(duì)照組、中藥高劑量組AMH 水平升高（P＜ 0.01）；其中，中藥中劑量組、中藥高劑量組E2水平明顯高于對(duì)照組（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。見表6。

表6 各組大鼠血清性激素水平比較（±s）

表6 各組大鼠血清性激素水平比較（±s）

注：與空白組比較，###P ＜ 0.001，####P ＜ 0.000 1；與模型組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1；與對(duì)照組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，△△△P ＜ 0.001，△△△△P ＜ 0.000 1。

AMH/（pg/mL）200.1 ± 1.94 152.8 ± 4.89###183.8 ± 1.92**152.5 ± 1.69△△157.7 ± 2.85△182.1 ± 9.07**組別空白組模型組對(duì)照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10 E2/（ng/L）82.19 ± 1.06 36.45 ± 0.41####62.84 ± 0.53****61.31 ± 2.00****70.48 ± 0.48****△△77.82 ± 0.58****△△△△FSH/（IU/L）20.06 ± 1.23 34.80 ± 1.56####17.79 ± 1.16****24.40 ± 1.21**△23.70 ± 1.35***17.58 ± 1.22****LH/（ng/L）22.66 ± 1.18 33.37 ± 0.77####21.61 ± 0.39****28.10 ± 0.48**△△△19.08 ± 0.30****21.01 ± 0.71****

3.6 各組大鼠卵巢組織PI3K、Akt、Bcl-2 及Bax mRNA表達(dá)比較

與空白組比較，模型組PI3K mRNA、Akt mRNA及Bcl-2 mRNA 表達(dá)明顯降低（P＜ 0.001，P＜0.000 1），Bax mRNA 表達(dá)明顯升高（P＜ 0.000 1）；與模型組比較，對(duì)照組、中藥高劑量組Akt mRNA 表達(dá)升高（P＜ 0.01，P＜ 0.001）；對(duì)照組、中藥中劑量組及中藥高劑量組PI3K mRNA、Bcl-2 mRNA 表達(dá)升高（P＜ 0.05，P＜ 0.001，P＜ 0.000 1），Bax mRNA表達(dá)逐漸降低（P＜ 0.01，P＜ 0.000 1）；其中中藥高劑量組Bax 蛋白表達(dá)低于對(duì)照組（P＜ 0.05）。見表7。

表7 各組大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax mRNA表達(dá)情況比較（±s）

表7 各組大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax mRNA表達(dá)情況比較（±s）

注：與空白組比較，###P ＜ 0.001，####P ＜ 0.000 1；與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1；與對(duì)照組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，△△△P ＜ 0.001。

Bax 0.44 ± 0.04 1.00 ± 0.03####0.71 ± 0.04**0.90 ± 0.07 0.58 ± 0.05***0.46 ± 0.02****△組別空白組模型組對(duì)照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10 PI3K 4.17 ± 0.21 1.00 ± 0.08####3.08 ± 0.27****1.67 ± 0.12△△△2.86 ± 0.04****3.58 ± 0.08****Akt 4.21 ± 0.35 1.00 ± 0.08####2.32 ± 0.20**1.48 ± 0.03 1.79 ± 0.07 2.83 ± 0.20***Bcl-2 3.17 ± 0.13 1.01 ± 0.10###2.16 ± 0.19*0.79 ± 0.06△△2.53 ± 0.23**2.91 ± 0.38***

3.7 各組大鼠卵巢組織PI3K、Akt、Bcl-2 及Bax 蛋白表達(dá)比較

與空白組比較，模型組PI3K、Akt 及Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜ 0.000 1），Bax 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜ 0.000 1）；與模型組比較，各給藥組PI3K、Akt 及Bcl-2 蛋白表達(dá)升高（P＜ 0.05，P＜0.01，P＜ 0.001，P＜ 0.000 1），對(duì)照組、中藥中劑量組及中藥高劑量組Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.000 1）；

其中，中藥高劑量組PI3K、Akt 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組（P＜ 0.000 1）；Bax 蛋白表達(dá)低于對(duì)照組（P＜0.05）。見圖2～5和表8。

圖2 各組大鼠卵巢組織中PI3K表達(dá)圖（ × 200）

圖3 各組大鼠卵巢組織中Akt表達(dá)圖（ × 200）

圖4 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2表達(dá)圖（ × 200）

圖5 各組大鼠卵巢組織中Bax表達(dá)圖（ × 200）

表8 各組大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax 蛋白表達(dá)情況比較（±s）

表8 各組大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax 蛋白表達(dá)情況比較（±s）

注：與空白組比較，####P ＜ 0.000 1；與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1；與對(duì)照組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，△△△P ＜ 0.001，△△△△P ＜ 0.000 1。

Bax 0.12 ± 0.00 0.19 ± 0.00####0.15 ± 0.00****0.19 ± 0.00△△△△0.13 ± 0.00****△△0.13 ± 0.00****△組別空白組模型組對(duì)照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10 PI3K 0.17 ± 0.00 0.06 ± 0.01####0.10 ± 0.00****0.08 ± 0.00***△△0.08 ± 0.00**△△△0.16 ± 0.00****△△△△Akt 0.14 ± 0.00 0.07 ± 0.00####0.10 ± 0.00****0.09 ± 0.00***0.10 ± 0.00****0.13 ± 0.00****△△△△Bcl-2 0.18 ± 0.00 0.11 ± 0.00####0.16 ± 0.00****0.12 ± 0.00*△△△△0.15 ± 0.00****0.15 ± 0.00****

4 討論

卵巢顆粒細(xì)胞是修復(fù)卵巢功能的關(guān)鍵，在FSH 和LH的共同作用下，卵巢顆粒細(xì)胞可以合成甾體激素雌激素和孕酮，在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。卵巢顆粒細(xì)胞功能受損時(shí)，不僅性激素生成受到影響，還能進(jìn)一步影響卵泡的發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致不同發(fā)育階段卵泡閉鎖發(fā)生［16-17］。卵巢顆粒細(xì)胞自噬、凋亡等異常是導(dǎo)致卵泡細(xì)胞過早過快閉鎖的原因之一，其發(fā)生與相關(guān)信號(hào)通路及基因密切相關(guān)，其中，最經(jīng)典的是通過PI3K/Akt信號(hào)通路影響B(tài)cl-2、Bax等［18-19］。

PI3K/Akt 信號(hào)通路負(fù)責(zé)許多細(xì)胞行為,包括生存、生長(zhǎng)和增殖。研究顯示，PI3K/Akt 通路廣泛參與卵巢顆粒細(xì)胞增殖、凋亡等過程，上調(diào)PI3K/AKT 表達(dá)能夠抑制卵巢組織損傷，以恢復(fù)卵巢功能［20-22］。凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡方式，發(fā)生在細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)階段。卵泡內(nèi)細(xì)胞異常凋亡與卵泡閉鎖密切相關(guān)，可導(dǎo)致卵巢功能的衰竭，是卵巢功能低下的主要發(fā)生機(jī)制。觸發(fā)凋亡有兩種途徑，分別是線粒體途徑（內(nèi)在途徑）和死亡受體途徑（外在途徑）。Bax 和Bcl-2 同屬于Bcl-2家族，在線粒體細(xì)胞凋亡途徑中起關(guān)鍵作用，并且已被證明可以調(diào)節(jié)卵巢凋亡。研究顯示益腎填精類中藥可以增加POI 大鼠卵巢的Bcl-2 蛋白表達(dá)，降低Bax 蛋白的表達(dá)，減少顆粒細(xì)胞凋亡，增加顆粒細(xì)胞分泌［23-25］。

腎為先天之本，藏精，主生殖，若腎精虧虛，則沖任失調(diào)，無血以下；肝腎精血互生、藏泄互用，若肝失濡養(yǎng)，疏泄失司，則氣機(jī)阻滯，氣血運(yùn)行失常；脾主統(tǒng)血，脾主運(yùn)化，若脾胃損傷，氣血不足，則化經(jīng)無源，血海失養(yǎng)。因此，肝、脾、腎功能正常，方能沖任調(diào)達(dá)，生化有源。

益腎調(diào)經(jīng)方是由左歸丸演變而來，方中熟地黃、淫羊藿、枸杞子為君，滋陰補(bǔ)血、益精填髓、溫腎壯陽，陰陽并補(bǔ)；臣以山茱萸、山藥、菟絲子平補(bǔ)肝腎之良藥，陰陽并治，陰平陽秘，使沖任調(diào)達(dá)，月經(jīng)如時(shí)以下；佐以肉蓯蓉、醋龜甲滋陰潛陽、益腎安神；當(dāng)歸、丹參養(yǎng)血活血、調(diào)經(jīng)止痛；黨參、黃芪補(bǔ)氣健脾；醋香附行氣疏肝、活血止痛。全方虛實(shí)并治，補(bǔ)腎為主，兼顧肝脾，同時(shí)輔以行氣、活血、補(bǔ)血之法，以達(dá)陰陽平衡，沖任調(diào)攝，月經(jīng)復(fù)常。

因此，本實(shí)驗(yàn)基于PI3K/Akt 通路及凋亡相關(guān)蛋白探討益腎調(diào)經(jīng)方治療POI 的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益腎調(diào)經(jīng)方能夠有效改善CTX 誘導(dǎo)的POI 模型大鼠的一般狀況，調(diào)節(jié)動(dòng)情周期和血清激素紊亂，同時(shí)上調(diào)PI3K、Akt mRNA 及蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖，原始卵泡的發(fā)育。此外，益腎調(diào)經(jīng)湯還能增強(qiáng)Bcl-2 的表達(dá)及抑制Bax 的表達(dá)，從而抑制大鼠卵巢顆粒細(xì)胞過度凋亡。其中，高劑量組效果最佳，與對(duì)照組（戊酸雌二醇）效果最為接近，甚至部分指標(biāo)優(yōu)于對(duì)照組。綜上，益腎調(diào)經(jīng)湯對(duì)POI 的治療作用可能是通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白實(shí)現(xiàn)。