李敏，劉芳媛，丁丹妮，韓鳳娟?

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

卵巢癌是威脅女性健康最常見的三大婦科惡性腫瘤之一［1］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，卵巢癌發(fā)病率占所有女性惡性腫瘤的2.5%［2］，但由于早期階段患者未見明顯的臨床癥狀，超過70%的女性首診即為卵巢癌晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）［3］，因此其病死率高，是婦科癌癥死亡的首要原因［4］。關(guān)于卵巢癌的治療一直是國際范圍內(nèi)的熱點(diǎn)問題，雖然手術(shù)治療、鉑類藥物化療和靶向治療等手段不斷發(fā)展［5］，但在治療過程中均會出現(xiàn)不同程度的藥物不良反應(yīng)，且患者五年生存率在40%左右，未見明顯改善［6］，其病死率呈上升趨勢［7］。中醫(yī)藥能夠增強(qiáng)卵巢癌放化療療效，減少不良反應(yīng)，延長患者生存期，提高生存質(zhì)量［8］，為晚期卵巢癌患者提供了更多選擇。

淫羊藿味辛、甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之效。本研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為“腎陽虛衰，血瘀于胞”是卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，其中陽氣虛衰是卵巢癌發(fā)病的根本原因［9］。淫羊藿溫煦腎陽、扶助相火，以達(dá)到治療卵巢癌的目的。黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院王秀霞教授創(chuàng)制的驗(yàn)方“理沖生髓飲”中重用淫羊藿，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)理沖生髓飲能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［10-11］。

目前從淫羊藿中提取到出明確具有抗卵巢癌活性的有效成分有淫羊藿苷、淫羊藿素和淫羊藿次苷Ⅱ［12-14］。本文就淫羊藿主要活性成分淫羊藿苷、淫羊藿素和淫羊藿次苷Ⅱ的抗卵巢癌研究現(xiàn)狀和作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為其治療卵巢癌的深入研究提供參考依據(jù)。

1 促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是由多種基因嚴(yán)格控制，多條信號通路協(xié)同參與的一種細(xì)胞死亡方式，是機(jī)體維持自身新陳代謝有序進(jìn)行的重要生理機(jī)制。內(nèi)源性線粒體凋亡是細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要途徑之一。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)部受到信號刺激時（如細(xì)胞氧化應(yīng)激、DNA 損傷、細(xì)胞生長因子缺失等），Bcl-2 家族蛋白通過改變線粒體外膜通透孔，通過控制線粒體通透性調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［15］，如Bax 通過在線粒體膜上打孔增加線粒體膜通透性，是促凋亡因子；而Bcl-2 插入線粒體膜減少線粒體膜通透性，是抑凋亡因子。當(dāng)線粒體膜通透性改變，線粒體中Cyt C的釋放及Caspase級聯(lián)反應(yīng)，促使Caspase-9的活化和進(jìn)一步激活Caspase-3 或Caspase-7，從而引起細(xì)胞凋亡［16］。

LI等［14］采用流式細(xì)胞術(shù)和Caspase-3比色法觀察在0、13、25、50 μmol/L 淫羊藿苷作用下的卵巢癌A2780 細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A2780 細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡且呈劑量依賴性，其凋亡的機(jī)制可能通過抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)了Caspase-3的活性，啟動細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑來實(shí)現(xiàn)。淫羊藿苷可抑制多種人卵巢癌細(xì)胞系的增殖，如A2780 細(xì)胞、SKOV3 細(xì)胞和SKVCR 細(xì)胞，通過下調(diào)Bcl-2 水平，上調(diào)Caspase-3表達(dá)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡［17-18］。研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿素可以同時調(diào)控促凋亡因子Bax和抑凋亡因子Bcl-2，發(fā)揮線粒體途徑凋亡的作用［19］。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路是卵巢癌患者腫瘤組織中異?；钴S的信號通路，也是抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵通道之一［20］，參與卵巢癌線粒體途徑凋亡。PI3K 接受上游信號如多種生長因子和信號傳導(dǎo)復(fù)合物被激活，被激活的PI3K 產(chǎn)生第二信使PIP3，促使Akt 蛋白磷酸化［21］。活化后的Akt 導(dǎo)致下游的一系列反應(yīng)，如調(diào)節(jié)Bcl-2 蛋白的活性，抑制卵巢癌細(xì)胞線粒體途徑凋亡［22］。同時Akt 直接或間接磷酸化mTOR。而mTOR 是負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)核糖體生成的重要調(diào)控因子，在細(xì)胞增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用［23］。

PTEN 是PIP3-磷酸酶，通過將PIP3 去磷酸化發(fā)揮與PI3K 相反的功能［22］，是PI3K/Akt信號通路的負(fù)調(diào)控因子，被稱為“抑癌基因”。侯科名等［24］將人卵巢癌細(xì)胞SKOV3 細(xì)胞接種于6 孔板，37 ℃培養(yǎng)過夜，之后以5、10、20 μmol/L 濃度的淫羊藿素處理48 h，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度淫羊藿素組SKOV3 細(xì)胞凋亡率較空白對照組顯著上升。同時，利用實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）法進(jìn)行檢測，結(jié)果表明淫羊藿素處理過的SKOV3細(xì)胞中PTEN 基因表達(dá)較空白組明顯上升，而PI3K、Akt 基因表達(dá)與之相反，且呈濃度相關(guān)性下降，蛋白印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)結(jié)果也予以佐證。淫羊藿素可以通過抑制PTEN 表達(dá)的方式調(diào)控PI3K/Akt信號通路，從而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的目的。

野生型p53 是重要的卵巢癌抑制基因［25］，與Akt/mTOR信號通路密切相關(guān)。p53可與Akt/mTOR 信號通路中蛋白結(jié)合，激活A(yù)kt活性［26］。淫羊藿素在40 μmol/L濃度下可以誘導(dǎo)卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞OV2008、C13*和卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞A2780 的凋亡，并且以時間依賴的方式增加卵巢癌細(xì)胞中p53 的磷酸化，抑制Akt 和mTOR 的磷酸化，以上研究表明淫羊藿素介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡與p53的激活和Akt/mTOR的抑制有關(guān)［27］。

2 影響卵巢癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移

卵巢癌細(xì)胞向周圍組織侵襲和遠(yuǎn)處組織轉(zhuǎn)移的惡性行為，是其與良性腫瘤的主要區(qū)別，直接影響卵巢癌預(yù)后的重要因素。淫羊藿苷通過抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而可以控制卵巢癌細(xì)胞的生長［28］。

2.1 抑制卵巢癌EMT

癌細(xì)胞借助上皮-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）過程獲得侵襲性和轉(zhuǎn)移性，是腫瘤組織轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵渠道［29］。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）作為一種鈣依賴型跨膜蛋白，其水平下降可以導(dǎo)致細(xì)胞的黏附力降低，中斷細(xì)胞間的相互作用，使癌細(xì)胞獲得易于侵襲和轉(zhuǎn)移的特性［30］。N-鈣黏蛋白（N-cadherin）是典型的成纖維細(xì)胞標(biāo)志物。研究顯示，術(shù)后病理組織中N-cadherin 高表達(dá)的卵巢癌患者更易觸發(fā)癌細(xì)胞侵襲，在5 年的隨訪中臨床復(fù)發(fā)率大約是N-cadherin 低表達(dá)患者的兩倍［31］。波形蛋白（Vimentin）主要存在于各種間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。作為間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，Vimentin 增加意味著間質(zhì)細(xì)胞表型的高表達(dá)。在EMT 過程中，Vimentin 與Snail、Slug、Twist 和ZEB1/2 等EMT 誘導(dǎo)劑的基因以及關(guān)鍵的表觀遺傳因子密切相關(guān)［32］。

李秋瑞等［33］經(jīng)劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，予以淫羊藿素5、10、20 μmol/L處理48 h后的卵巢癌細(xì)胞A2780 侵襲遷移數(shù)量和侵襲遷移率明顯減少。與此同時，Western blot 與PCR 結(jié)果顯示，E-cadherin 的蛋白和mRNA表達(dá)上升，N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平總體下降。該研究提示淫羊藿素可通過阻止卵巢癌細(xì)胞EMT 的進(jìn)程，減弱其遷移、侵襲能力，該作用呈濃度依賴性。在EMT 過程中，Akt/mTOR 信號通路已被證實(shí)發(fā)揮著不可忽視的誘導(dǎo)作用。Akt/mTOR 信號通路的磷酸化，激活EMT 誘導(dǎo)劑因子Snail、Slug、Twist 等在細(xì)胞核中的聚集，導(dǎo)致E-cadherin 表達(dá)下降［34］。淫羊藿素可以抑制Akt/mTOR 信號通路的磷酸化，增加E-cadherin 的表達(dá)，降低Vimentin 的表達(dá)，對順鉑敏感的卵巢癌細(xì)胞和順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞的遷移與侵襲具有明顯的抑制作用［35］。

2.2 抑制卵巢癌侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白酶

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）被認(rèn)為是癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移過程中重要的蛋白水解酶。腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）與癌細(xì)胞基底共同構(gòu)成腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的第一道生物屏障［36］。MMPs 能夠降解ECM 中大部分蛋白成分的蛋白酶，影響細(xì)胞間黏附因子的效力，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破癌細(xì)胞基底和ECM，完成侵襲和轉(zhuǎn)移［37］。MMPs有20多種，目前研究對MMP-2、MMP-9較為深入。MMP-2和MMP-9在水解ECM 這一物理屏障的同時，使得ECM 內(nèi)部各種細(xì)胞因子（如VEGF、生長因子TGF-β、炎性因子IL-8）得以釋放并活化［38-39］，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤血管的新生，為腫瘤組織的侵襲與轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)支持和代謝通道。

研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌病理組織中的MMP-2、MMP-9經(jīng)免疫組化SABC 三步法檢測，均呈陽性表達(dá)，并且與卵巢癌患者的臨床分期存在相關(guān)性［40］。進(jìn)一步的研究顯示，MMP-2 和MMP-9 在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，而敲除MMP-2 和MMP-9 可以減弱卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移［41］。何泉［42］研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷對卵巢癌細(xì)胞SKOV3侵襲與轉(zhuǎn)移能力的影響呈濃度相關(guān)性上升，通過RT-PCR 檢測證明卵巢癌細(xì)胞中的MMP-2、MMP-9mRNA 表達(dá)隨著淫羊藿苷劑量的增加而下降，因此淫羊藿苷可以通過抑制MMP-2、MMP-9 水平，從而影響卵巢癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

3 阻滯卵巢癌細(xì)胞周期

細(xì)胞周期的運(yùn)行決定細(xì)胞增殖的速率，阻滯卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞周期可以有效地抑制卵巢癌的發(fā)展［43］。

3.1 靶向相關(guān)蛋白阻滯細(xì)胞周期

細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物質(zhì)周期蛋白依賴性激酶（CDK）及調(diào)節(jié)其功能的細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）共同推動細(xì)胞通過G1/S 期檢查點(diǎn)進(jìn)入DNA 的合成和G2/M期檢查點(diǎn)開始有絲分裂［44-45］。Cyclin D1 和Cyclin E 是細(xì)胞周期G1/S期檢查點(diǎn)調(diào)控蛋白，Cyclin B1蛋白是G2/M期檢查點(diǎn)調(diào)控蛋白，均擔(dān)任推動細(xì)胞通過檢查點(diǎn)的調(diào)控作用［46］。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI，如p21、p16、p53等）與Cyclin相拮抗，抑制CDK的活性，維持細(xì)胞周期運(yùn)行的動態(tài)平衡。Cyclin過度激活或抑制CKI活性均會打破了這種動態(tài)平衡［47-48］。p53能激活CKI1產(chǎn)生p21蛋白，抑制CDK-Cyclin磷酸化激酶活性，阻滯卵巢癌細(xì)胞周期運(yùn)行［49］。

研究發(fā)現(xiàn)，25 μg/mL 的淫羊藿苷可以將SKOV3細(xì)胞阻滯在G2/M 期，抑制其增殖［50］。在用淫羊藿苷（1×10-6mol/L）處理過的SKOV3 細(xì)胞G1 期百分比上升，G2 期細(xì)胞無明顯變化，S 期細(xì)胞顯著下降，Cyclin D1 和Cyclin E 的蛋白質(zhì)和mRNA 水平顯著降低，p21蛋白和mRNA 表達(dá)上升，說明淫羊藿苷可以通過提高p21 水平，抑制CDK 和Cyclin 對SKOV3 細(xì)胞周期的調(diào)控作用，將細(xì)胞阻滯在G1期［51］。以20 μmol/L濃度的淫羊藿素處理過的p53野生型C13*細(xì)胞株的G1期百分比升高，Cyclin E蛋白表達(dá)下降，p53蛋白表達(dá)上升［52］，說明淫羊藿素可以靶向激活p53蛋白，使細(xì)胞中周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin表達(dá)下降，抑制卵巢癌細(xì)胞的生長。

3.2 調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路阻滯細(xì)胞周期

Wnt/β-catenin 信號通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［53］。通過Wnt/β-catenin 信號通路對下游細(xì)胞周期相關(guān)靶基因的激活，可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖［54］。β-catenin 是該通路上的核心蛋白分子，將信號從細(xì)胞質(zhì)傳遞到細(xì)胞核。細(xì)胞外Wnt 配體蛋白與靶細(xì)胞膜上的Wnt 受體蛋白結(jié)合，從而激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白，β-catenin 降解復(fù)合物的降解活性得以抑制，游離狀態(tài)的β-catenin 在細(xì)胞質(zhì)中不斷蓄積并最終入核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，刺激下游諸多靶基因，如c-myc、Cyclin D1、survivin 的轉(zhuǎn)錄［55］。而c-myc、Cyclin D1、survivin 均是細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的調(diào)控因子。淫羊藿苷能夠降低Wnt/β-catenin 通路中β-catenin 的表達(dá)，并且能夠抑制其下游c-myc、Cyclin D1 的基因表達(dá)和蛋白水平，同時細(xì)胞增殖也受到抑制［51，56］。microRNAs是Wnt/β-catenin信號通路的重要調(diào)控因子。FU等［57］通過GSEA分析在用淫羊藿苷處理過的卵巢癌SKOV3細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號通路被顯著下調(diào)，繼而抑制該信號通路下游靶蛋白Cyclin D1 和survivin 的表達(dá)，使用miR-1-3p 抑制劑可以逆轉(zhuǎn)淫羊藿苷對Wnt/β-catenin 通路的抑制，并且在BALB/C 鼠的卵巢癌組織中同樣得以驗(yàn)證，說明淫羊藿苷通過上調(diào)卵巢癌中miR-1-3p 水平抑制Wnt/β-catenin 信號通路，從而阻滯Wnt/β-catenin 信號通路下游蛋白對細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的調(diào)控。

4 誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬

自噬有利于細(xì)胞在外界刺激中，通過利用溶酶體降解自身胞內(nèi)蛋白和受損細(xì)胞器，維持自身穩(wěn)態(tài)。自噬缺陷會影響DNA 損傷的正確修復(fù)和致癌因子的激活，導(dǎo)致卵巢癌的發(fā)生［58］。自噬激活有助于抑制卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。mTOR 是調(diào)節(jié)自噬的重要因子。當(dāng)細(xì)胞處于生長激素受限，營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下，Akt 調(diào)節(jié)mTOR 失能，AMPK 通過磷酸化TSC2，使mTOR 活性受到抑制，其下游的ULK1激活，活化的ULK1將Beclin-1磷酸化［59］，這是誘導(dǎo)自噬的重要條件。Beclin-1 是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的第一個與自噬相關(guān)的基因。Beclin-1 和ATG-5 分別與其他蛋白形成復(fù)合物，促成自噬體的形成［60］。p62 表達(dá)往往與自噬活性呈負(fù)相關(guān)。在自噬體延伸階段，p62能夠連接LC3（公認(rèn)的自噬標(biāo)記物）和聚泛素化蛋白之間的橋梁，與新的自噬體膜結(jié)合，參與新的自噬體膜的形成［61］。YUAN 等［19］經(jīng)Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)60 μmol/L 淫羊藿次苷Ⅱ處理SKOV3 細(xì)胞中Akt、mTOR、p62 表達(dá)下降，p-AMPKα、Beclin-1、ATG-5 表達(dá)較對照組上升，說明淫羊藿次苷Ⅱ激活自噬生成和自噬體的延伸。miRNA 也參與卵巢癌自噬的調(diào)節(jié)。當(dāng)淫羊藿次苷Ⅱ與miR-144-3p 抑制劑結(jié)合處理SKOV3 細(xì)胞時表現(xiàn)出對自噬的抑制［19］。IGF2R 是Akt/mTOR 通路的上游調(diào)節(jié)因子，miR-144-3p 是IGF2R 的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。miR-144-3p 通過靶向IGF2R 抑制Akt/mTOR 通路參與自噬的調(diào)節(jié)。

5 促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞焦亡

不同于細(xì)胞凋亡的溶解性死亡途徑，細(xì)胞焦亡是一種通過細(xì)胞不斷膨脹變大致使細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞內(nèi)容物向細(xì)胞外微環(huán)境的釋放，由此激發(fā)胞外炎癥反應(yīng)的一種程序性死亡方式［62］。細(xì)胞焦亡在惡性腫瘤中扮演著重要角色，參與腫瘤免疫微環(huán)境和激發(fā)抗卵巢瘤的免疫應(yīng)答［63-64］。在經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑中，NLRP3、NLRC4、AIM2、Pyrin 等在細(xì)胞內(nèi)感應(yīng)到細(xì)胞壓力信號（如感染、炎癥、氧化應(yīng)激等）后被激活，形成炎性小體，并將pro-caspase-1 切割成為具有活性的Caspase-1，Caspase-1 將繼續(xù)切割pro-IL-1β，形成有生物活性的IL-1β 并釋放在細(xì)胞外，擴(kuò)大細(xì)胞外炎癥反應(yīng)，激發(fā)機(jī)體內(nèi)的免疫應(yīng)答［65］。

淫羊藿苷對卵巢癌的抗腫瘤作用部分是通過激活細(xì)胞焦亡實(shí)現(xiàn)的。氧化應(yīng)激通過產(chǎn)生過多的ROS，破壞線粒體釋放的DNA，激活NLRP3 等炎癥小體，是引發(fā)細(xì)胞焦亡原因之一［66］。以淫羊藿次苷Ⅱ干預(yù)SKOV3細(xì)胞6 h后細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著增加。Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ROS 含量增加上調(diào)了SKOV3 細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 等蛋白的表達(dá)［67］。以上研究證實(shí)淫羊藿次苷Ⅱ可以通過誘導(dǎo)卵巢癌氧化應(yīng)激激活細(xì)胞焦亡以此拮抗腫瘤的發(fā)展。

6 結(jié)語與展望

目前淫羊藿活性成分對卵巢癌的研究主要在實(shí)驗(yàn)階段，通過檢測相關(guān)因子的活性、基因表達(dá)和蛋白水平，探索淫羊藿苷在促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡、影響卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移、阻滯卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬和促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞焦亡方面的作用機(jī)制，表明淫羊藿活性成分具有治療卵巢癌的可能。2023年1月以淫羊藿素為主要成分的中藥制劑淫羊藿素軟膠囊被國家藥監(jiān)局優(yōu)先審評批準(zhǔn)上市，但其適用范圍尚未涉及卵巢癌。將來在充實(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的同時，應(yīng)積極開展淫羊藿素軟膠囊治療卵巢癌的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)，拓寬淫羊藿素軟膠囊的適用范圍，發(fā)揮中國傳統(tǒng)醫(yī)藥在抗卵巢癌治療方面的優(yōu)勢，為卵巢癌患者的治療提供新的選擇。