陳沙 王桂云 李榮慧 向振 吳結(jié)枝 卓海燕 劉平安 張國(guó)民

〔摘要〕 目的 從動(dòng)情周期、骨密度、骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）生長(zhǎng)曲線4個(gè)層次判定雌性大鼠手術(shù)去勢(shì)造模是否成功。方法 30只2月齡SPF級(jí)雌性大鼠，隨機(jī)平均分為空白組、假手術(shù)組和模型組3組。手術(shù)去勢(shì)造模完成后次日起連續(xù)7 d對(duì)3組大鼠進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，判斷動(dòng)情周期。造模后第8天取左側(cè)股骨組織做骨密度測(cè)定和HE染色，取右側(cè)骨組織分離原代BMMSCs。結(jié)果 空白組和假手術(shù)組動(dòng)情周期正常，模型組大鼠動(dòng)情周期紊亂;骨組織HE染色顯示模型組骨小梁稀少且間距加大;與空白組比較，假手術(shù)組骨密度和BMMSCs生長(zhǎng)速率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與假手術(shù)組相比，模型組骨密度顯著降低，BMMSCs生長(zhǎng)速率顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 造模成功后的雌性大鼠動(dòng)情周期紊亂，骨密度降低，骨小梁疏松，BMMSCs的生長(zhǎng)緩慢，為骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型建立判定提供較全面的依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 去勢(shì)雌性大鼠;骨質(zhì)疏松癥;動(dòng)物模型;動(dòng)情周期;骨密度;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R-332 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.11.003

〔Abstract〕 Objective To determine the success of female rats' surgical castration model from four levels of estrus cycle， bone density， bone tissue morphology and primary bone marrow mesenchymal stem cells （BMMSCs） growth curve. Methods Thirty two-month-old SPF female rats were randomly and equally divided into 3 groups： a blank group， a sham operation group and a model group. The vaginal exfoliated cell smears were performed on the 3 groups of rats for 7 consecutive days after the completion of the surgical castration model to determine the estrus cycle. On the 8th day after modeling， the left femur tissue was taken for bone density determination and HE staining， and the right bone tissue was separated from primary BMMSCs. Results The estrous cycle of the blank group and the sham operation group was normal， and the estrus cycle of the model group was disordered. The HE staining of bone tissue showed that the bone trabecula of the model group was sparse and the spacing increased; Compared with the blank group， the differences in bone density and BMMSCs growth rate of the sham operation group had no statistical significance （P>0.05）. Compared with the sham operation group， the bone density of the model group was significantly reduced， and the growth rate of BMMSCs was significantly reduced. The difference was statistically significant （P<0.01）. Conclusion After successful modeling， female rats have estrous cycle disorder， decreased bone density， bone trabecula porosity， and slow growth of BMMSCs， which provide a more comprehensive basis for the establishment of osteoporosis animal models.

〔Keywords〕 ovariectomized female rat; osteoporosis; animal model; estrous cycle; bone density; bone marrow mesenchymal stem cells

根據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局調(diào)查顯示[1]，我國(guó)65歲以上人口接近1.4億（約占總?cè)丝诘?0.1%），是世界上老年人口絕對(duì)數(shù)最多的國(guó)家。有專(zhuān)家預(yù)測(cè)[2]，2050年我國(guó)用于治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥性骨折費(fèi)用將達(dá)1 630億元。隨著人口老齡化趨勢(shì)的日益加重，骨質(zhì)疏松癥將成為我國(guó)重要的公共健康問(wèn)題，因此，開(kāi)展骨質(zhì)疏松癥研究具有較高的科學(xué)價(jià)值。目前，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確，在針對(duì)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生機(jī)制開(kāi)展的各種研究方法中，動(dòng)物模型是目前較為常用的一種研究方法。造模方法中的手術(shù)去勢(shì)是指通過(guò)去除雌性大鼠雙側(cè)卵巢的方法造成雌激素水平急劇下降、骨量大量丟失，建立骨質(zhì)疏松癥模型，具有建模因素單一、建模成功率高、可重復(fù)性好、可信度高和能夠很好地體現(xiàn)雌激素水平下降這一重要病理生理現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)[3]。本實(shí)驗(yàn)采用雌性大鼠作為研究動(dòng)物[4]，通過(guò)陰道脫落細(xì)胞涂片、股骨密度測(cè)定、骨組織形態(tài)和原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone

marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）生長(zhǎng)曲線4個(gè)層次的客觀指標(biāo)來(lái)判定造模是否成功[5]。

1 材料

1.1 ?動(dòng)物

SPF級(jí)SD雌性大鼠，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，體質(zhì)量190～250 g，6～8周齡，30只，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)單位許可證號(hào)：SYXK（湘）2013-005。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)。環(huán)境溫度為（22±4） ℃，濕度為50%±10%，自由進(jìn)食進(jìn)水，飼料為標(biāo)準(zhǔn)普通飼料（湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），并保持環(huán)境安靜，定時(shí)清掃鼠籠衛(wèi)生。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的要求，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 ?試劑

低糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)8657263）;FBS胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)42A0071K）;雙抗（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)1999384）;Trypsin-EDTA（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)1868583）;PBS（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)AD1779227）;CCK-8試劑盒（上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，批號(hào)20190124）;FITC anti-mo/rat CD29抗體（美國(guó)eBioscience公司，批號(hào)11-0291-80）;FITC anti-rat CD90抗體（美國(guó)Biolegend公司，批號(hào)206105）;CD34（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)ab81289）;CL488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)SA00013-2）等。

1.3 ?儀器

HR30-IIA2型生物安全柜（中國(guó)海爾集團(tuán)公司）;311型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）;AE2000型倒置顯微鏡（中國(guó)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）;低速離心機(jī)（美國(guó)萊伯特公司）;DCW-3510型恒溫水浴鍋（中國(guó)寧波新芝生物科技股份有限公司）;全身雙能X線骨密度儀（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）;MIAS型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）;Ni-U型研究型正置顯微鏡（日本株式會(huì)社尼康公司）;A00-1-1102型流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）等。

2 方法

2.1 ?動(dòng)物分組及造模

按照隨機(jī)數(shù)字表法將30只SPF級(jí)雌性大鼠分為空白組、假手術(shù)組和模型組3 組，每組10只。模型組采用去除雌性大鼠雙側(cè)卵巢方法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型[5-6]，現(xiàn)配10%的水合氯醛溶液，濃度為3 mL/kg。假手術(shù)組和模型組大鼠腹腔注射水合氯醛溶液麻醉，俯臥位固定于大鼠板上，剃毛消毒后，沿第一胸腰椎兩側(cè)外1 cm處縱向切開(kāi)皮膚肌肉，分離找到卵巢，結(jié)扎后完整摘除兩側(cè)卵巢，分兩層縫合切口，用無(wú)菌生理鹽水沖洗傷口，絡(luò)合碘消毒[7]。術(shù)后連續(xù)3 d在假手術(shù)組和造模組大鼠后腿肌肉內(nèi)側(cè)注射青霉素，每只4萬(wàn)IU/d，6 d后拆線，空白組不做任何處理。

2.2 ?雌性大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片

造模后第1天清晨10點(diǎn)，取空白組、假手術(shù)組和模型組3組大鼠，用小號(hào)無(wú)菌棉簽進(jìn)入大鼠陰道內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)棉簽后，將陰道分泌物涂抹在已經(jīng)滴加了少量生理鹽水的防脫玻片上（均勻平鋪即可），待玻片自然風(fēng)干后進(jìn)行HE染色，1次/d，連續(xù)7 d。將7 d的玻片收集到一塊進(jìn)行HE染色。

2.3 ?骨密度測(cè)定和骨組織HE染色觀察微細(xì)結(jié)構(gòu)

造模后第8天，采用頸椎脫臼法處死所有動(dòng)物。左側(cè)股骨組織用于骨密度測(cè)定和骨組織HE染色。每組5只雌性大鼠左后肢用濕紗布包裹，送至湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心送檢，用Unigamma X-RAY Plus雙能X線骨密度儀檢測(cè)雌鼠左后肢股骨密度。每組另5只雌性大鼠左后肢去除毛發(fā)后固定在4%PFA中，在5%的硝酸中脫鈣7 d，進(jìn)行HE染色[8]，檢測(cè)股骨病理形態(tài)學(xué)變化。

2.4 ?BMMSCs的分離

造模后第8天，各組大鼠右側(cè)骨組織均用于提取BMMSCs。全骨髓貼壁法分離BMMSCs及傳代培養(yǎng)：清潔消毒操作區(qū)域，細(xì)胞房紫外消毒滅菌30 min，將大鼠右后肢在裝有醫(yī)用酒精的燒杯中浸泡2 min后剪去毛發(fā)及肌肉顯露骨組織，剪斷骨組織兩端骨骺露出骨髓腔，用預(yù)先配制好的DMEM完全培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，將沖洗液收集在無(wú)菌15 mL BD管中，離心去上清，加完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸后，轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，做好組別和P0代標(biāo)記。

2.5 ?BMMSCs的鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)至P2代后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。各取100 μL細(xì)胞懸液，分別加入到含抗體的離心管中，每種抗體分成5份，3種抗體總計(jì)15管，混勻，4 ℃避光孵育30 min，同時(shí)設(shè)置一管不染抗體管，具體標(biāo)記如下（未染：不加抗體，不做染色;CD34：染CD34抗體;CD29：染CD29-FITC抗體;CD90：染CD90-FITC抗體），PBS洗細(xì)胞2次，800 rpm離心5 min;其中CD34管繼續(xù)加入100 μL CL488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）二抗（1∶100稀釋?zhuān)?，繼續(xù)避光孵育1 h，PBS洗細(xì)胞2次，800 rpm離心5 min，350 μL PBS重懸細(xì)胞。上機(jī)檢測(cè)，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及表面標(biāo)記抗原CD90、CD29和CD34的鑒定。

2.6 ?BMMSCs生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將P2代細(xì)胞胰酶消化，加入完全培養(yǎng)液終止消化后800 rpm離心5 min，去上清，重新加入完全培養(yǎng)液，對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMMSCs在濃度為2×104個(gè)/mL時(shí)，CCK-8試劑盒檢測(cè)結(jié)果較為理想。該細(xì)胞生長(zhǎng)周期為7 d，所以繪制完整的生長(zhǎng)曲線需要7塊96孔板。按2×103個(gè)/孔，每孔100 μL接種到96孔板當(dāng)中，依次加入空白組、假手術(shù)組、模型組細(xì)胞懸液，每組做5個(gè)復(fù)孔。第1天，在各孔中加入CCK-8溶液10 μL，4 h后在450 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行OD值測(cè)定，依次7 d，繪制BMMSCs的生長(zhǎng)曲線。

2.7 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用“x±s”表示，多組間分析用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?動(dòng)情周期判斷

由圖1可知，空白組和假手術(shù)組的大鼠有穩(wěn)定的動(dòng)情周期，模型組則持續(xù)性在動(dòng)情前期和動(dòng)情間期，動(dòng)情周期紊亂。動(dòng)情前期，陰道脫落細(xì)胞大部分是有細(xì)胞核上皮細(xì)胞，偶見(jiàn)少量角化上皮細(xì)胞;動(dòng)情期，可見(jiàn)大部分無(wú)核角化細(xì)胞;動(dòng)情后期階段，白細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞和角化細(xì)胞伴行出現(xiàn);動(dòng)情間期時(shí)，白細(xì)胞不斷增多，角化細(xì)胞持續(xù)減少，直到后期以白細(xì)胞為主。

3.2 ?雌性大鼠股骨密度測(cè)定

與空白組比較，假手術(shù)組股骨密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組股骨密度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.3 ?股骨HE染色結(jié)果分析

空白組和假手術(shù)組骨膜完整，骨小梁致密且寬，骨領(lǐng)中有數(shù)量較為豐富的成骨細(xì)胞，可見(jiàn)初級(jí)骨化中心與骨髓腔形成，許多初級(jí)骨髓腔融合成一個(gè)不斷增大并加長(zhǎng)的骨髓腔;模型組骨髓腔較小，細(xì)胞種類(lèi)少，骨小梁稀少且窄，小梁間距加大，骨膜較不完整。如圖3所示。

3.4 ?BMMSCs的鑒定

流式細(xì)胞儀鑒定后發(fā)現(xiàn)，模型組BMMSCs的CD90、CD29陽(yáng)性表達(dá)分別為63.41%和50.99%，而CD34陽(yáng)性比為5.31%。結(jié)果如圖4所示。

3.5 ?BMMSCs生長(zhǎng)速率OD值曲線

空白組、假手術(shù)組和模型組第3天和第7天生長(zhǎng)速率OD值見(jiàn)表1。與空白組比較，假手術(shù)組生長(zhǎng)速率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與假手術(shù)組比較，模型組生長(zhǎng)速率均顯著降低（P<0.01）。

從圖5可以看出各組BMMSCs的生長(zhǎng)曲線呈“S”形，空白組和假手術(shù)組進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期正常，為第3天，模型組進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較慢，為第4天。從第2天起，各組BMMSCs的生長(zhǎng)加快。第3天起，與空白組比較，假手術(shù)組生長(zhǎng)速率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組生長(zhǎng)速率差異降低（P<0.01），細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以后，生長(zhǎng)趨勢(shì)一致。第7天細(xì)胞生長(zhǎng)速率不再增加，趨于平穩(wěn)。各組生長(zhǎng)速率趨勢(shì)為：空白組=假手術(shù)組>模型組。

4 討論

人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型是生物醫(yī)學(xué)研究中所建立的，能模擬人類(lèi)疾病表現(xiàn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象，是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)重要手段[6]。從動(dòng)物模型中可較為客觀地反應(yīng)疾病特點(diǎn)，對(duì)科學(xué)研究具有一定幫助。由于骨質(zhì)疏松癥是一種病程較長(zhǎng)的疾病，在不同階段有不同的特點(diǎn)，雌性大鼠作為手術(shù)去勢(shì)造模的方法已較為成熟。隨著基礎(chǔ)研究的深入，判定去勢(shì)造模的依據(jù)將會(huì)越來(lái)越接近臨床實(shí)際，為患者和疾病規(guī)律探索作出貢獻(xiàn)。

手術(shù)去勢(shì)法造模因素單一，重復(fù)性強(qiáng)，具有較高的可信度，但是雌激素水平突然迅速地降低，這與自然病程中雌激素長(zhǎng)期、緩慢地下降不一致[3]。陰道脫落細(xì)胞具有較易涂片、在體實(shí)驗(yàn)和操作相對(duì)簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，且細(xì)胞類(lèi)型經(jīng)染色固定后形態(tài)很難發(fā)生改變，能動(dòng)態(tài)反應(yīng)動(dòng)情周期中各期的細(xì)胞類(lèi)型，但在遇上陰道感染時(shí)，也可見(jiàn)大量白細(xì)胞，難以與以白細(xì)胞為主的動(dòng)情間期相區(qū)分，常易因操作不當(dāng)導(dǎo)致假陽(yáng)性[9]。雙能骨密度儀測(cè)取的骨密度方法具有準(zhǔn)確度高、測(cè)量時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)[10]，是檢測(cè)為骨質(zhì)疏松癥的“金標(biāo)準(zhǔn)”。王德志等[11]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中觀察到，骨密度的降低程度在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中不能完全反映骨組織微結(jié)構(gòu)的退變程度，認(rèn)為評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松癥嚴(yán)重程度及骨組織力學(xué)的改變時(shí)，不能單純憑測(cè)量骨密度來(lái)決定，在實(shí)驗(yàn)研究和臨床工作中應(yīng)該結(jié)合其他檢測(cè)方法來(lái)共同評(píng)估骨質(zhì)疏松癥。股骨HE染色看到的骨小梁形態(tài)變化和骨髓腔加大現(xiàn)象是骨生成的體現(xiàn)，伴隨有初級(jí)骨髓腔的形成，顯示骨發(fā)生現(xiàn)象。去卵巢后大鼠骨量的丟失主要發(fā)生在以骨小梁為主的松質(zhì)骨[12-13]，由于松質(zhì)骨在大鼠骨中占大部分，因此，骨小梁的減少會(huì)導(dǎo)致骨密度的下降。骨組織HE染色對(duì)于股骨端和脛骨端的皮質(zhì)骨的研究沒(méi)有松質(zhì)骨充分，作為去勢(shì)指標(biāo)的判定具有一定的局限性。BMMSCs是一種具有多種分化能力的細(xì)胞，既能成骨分化，又能成脂分化。去除卵巢后的大鼠BMMSCs功能受到抑制，其原代培養(yǎng)具有一定的時(shí)間周期，培養(yǎng)條件相對(duì)繁瑣。

在大鼠去勢(shì)造模判定方法中，有一系列評(píng)價(jià)的客觀指標(biāo)，主要有骨密度測(cè)定、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)和陰道脫落細(xì)胞涂片檢測(cè)等，其中最主要的是骨密度與骨組織病理學(xué)變化這兩項(xiàng)指標(biāo)[14]，本論文主要采用觀察陰道脫落細(xì)胞涂片、股骨骨密度的測(cè)定、骨組織病理學(xué)變化和BMMSCs生長(zhǎng)周期變化4種方法證明去勢(shì)是否成功。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于假手術(shù)組，模型組雌性大鼠陰道脫落細(xì)胞動(dòng)情周期紊亂;股骨密度顯著降低，骨組織HE染色骨小梁間距增寬，骨小梁稀少且窄;模型組BMMSCs生長(zhǎng)速率變緩，呈現(xiàn)衰老趨勢(shì)。相較而言，股骨密度測(cè)定和陰道脫落細(xì)胞涂片是較為省時(shí)、省力且結(jié)果較為準(zhǔn)確的量化標(biāo)準(zhǔn)。目前，任何骨檢測(cè)方法均有其各自的局限性和適用情況，本研究力圖從手術(shù)去勢(shì)造模角度出發(fā)，對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松癥模型建立進(jìn)行“宏觀到微觀、二維到三維、定性到定量”分析，為單一項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)方案動(dòng)物去勢(shì)判定提供了較為全面的依據(jù)。

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