趙崇屹,周景文,徐沙*

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學(xué) 未來食品科學(xué)中心,江蘇 無錫,214122)

玉米黃質(zhì),也被稱作玉米黃素,其分子式為C40H56O2,是一種常見的橙黃色含氧烯萜類化合物,屬于類胡蘿卜素,作為四萜的含氧衍生物,同時(shí)包含11個(gè)共軛的碳碳雙鍵(圖1)。玉米黃質(zhì)擁有較好的脂溶性,廣泛的存在于橙色、紅色以及黃色植物花朵或果實(shí)中,由β-胡蘿卜素經(jīng)β-胡蘿卜素羥化酶CrtZ催化而來。玉米黃質(zhì)與其同分異構(gòu)體葉黃素都具有較強(qiáng)的抗氧化性,對(duì)一些如老年黃斑變性、白內(nèi)障以及腫瘤之類的疾病有預(yù)防作用[1-3]。玉米黃質(zhì)含有的多個(gè)共軛碳碳雙鍵,既可以吸收部分波長的可見光使玉米黃質(zhì)晶體顯色,又會(huì)受到熱量的影響變得不穩(wěn)定,還會(huì)受到缺電子的基團(tuán)以及金屬離子的攻擊,在受到這些因素影響的同時(shí),這些雙鍵還可以淬滅掉游離的單態(tài)氧[4]。這些效果導(dǎo)致了玉米黃質(zhì)在較高溫度下及光照等條件下具有不穩(wěn)定性,容易被氧化。玉米黃質(zhì)和葉黃素都存在于視網(wǎng)膜中[5],并被證明與視網(wǎng)膜健康有關(guān)[6]。玉米黃質(zhì)不能由人體合成,所以需要通過食物補(bǔ)充[7]。

圖1 玉米黃質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of zeaxanthin

玉米黃質(zhì)的主要合成方法包括植物提取法、化學(xué)合成法以及生物合成法3種。其中,植物提取法主要通過從黃色的蔬菜和水果(如玉米、辣椒、橙子、甜瓜和芒果)中提取玉米黃質(zhì),通過一些提取技術(shù)獲得的玉米黃質(zhì)依舊可以保持多種功能活性,但這種方法帶來的問題(如較低的產(chǎn)率和產(chǎn)量、提取過程中帶來的廢料物質(zhì)和環(huán)境污染)限制了植物提取法的發(fā)展空間[8-9]。而化學(xué)合成法獲得玉米黃質(zhì)較為困難,合成過程成本較高且步驟繁雜,合成得到的玉米黃質(zhì)具有較差的生物活性,只能用作染料用途[10],因此化學(xué)合成不是獲得玉米黃質(zhì)的優(yōu)先選擇。最后,玉米黃質(zhì)的微生物生產(chǎn)可以用野生或工程微生物進(jìn)行[11-12]。應(yīng)用微生物合成玉米黃質(zhì)具有原材料成本低、環(huán)境污染小的優(yōu)點(diǎn),這兩方面都提高了玉米黃質(zhì)可持續(xù)生產(chǎn)的可能性。此外,微生物的代謝工程也提供了另一種從本身無法合成玉米黃質(zhì)的菌株中得到玉米黃素的方法[13]。由于玉米黃質(zhì)的安全性以及生物活性,利用新的生物技術(shù)合成玉米黃質(zhì)受到了更多的關(guān)注,很多的基因操作可用于增強(qiáng)玉米黃質(zhì)在細(xì)菌、酵母和微藻中的積累。

萜類化合物可以通過兩個(gè)基本的結(jié)構(gòu)單元異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)以及二甲基丙烯焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)合成,這兩種物質(zhì)在一定的條件下可以互變。在釀酒酵母中含有可以為合成萜類物質(zhì)提供前體的甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway,MVA)。將MVA中產(chǎn)生的IPP和DMAPP 作為前體,通過香葉基香葉基二磷酸合成酶(CrtE)生成香葉基香葉基二磷酸酯(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP),在八氫番茄紅素合成酶(CrtB)的作用下合成八氫番茄紅素,最后再由八氫番茄紅素去飽和酶(CrtI)得到一系列中間產(chǎn)物和最終的產(chǎn)物番茄紅素[14],番茄紅素再通過番茄紅素折疊酶(CrtYB)和β-胡蘿卜素羥化酶(CrtZ)反應(yīng)生成玉米黃質(zhì),玉米黃質(zhì)在釀酒酵母中合成的整個(gè)過程如圖2所示。

圖2 玉米黃質(zhì)的從頭合成Fig.2 De novo synthesis of zeaxanthin

BHOSALE等[15]使用多食黃桿菌(Flavobacteriummultivorum)合成玉米黃質(zhì)積累量達(dá)到(10.65±0.63) μg/mL。ASKER等[16]使用了玉米黃原中黃桿菌(Mesoflavibacterzeaxanthinifaciens)合成玉米黃質(zhì),積累量[以細(xì)胞干重(dry cell weight,DCW)計(jì)]可以達(dá)到910 μg/g DCW。SUN等[17]通過將木糖利用途徑以及玉米黃質(zhì)合成途徑整合到釀酒酵母中得到了一株可以吸收木糖合成玉米黃質(zhì)的菌株,玉米黃質(zhì)的產(chǎn)量為0.74 mg/L。LIANG等[18]利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子最終使產(chǎn)量提高了50倍,使釀酒酵母中玉米黃質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到了37 mg/L。SINGH等[19]成功使用小球藻(Chlorellasaccharophila)作為工程菌合成了玉米黃質(zhì)。玉米黃質(zhì)在合成后會(huì)積累在細(xì)胞內(nèi)部,有可能產(chǎn)生細(xì)胞毒性,李方迪等[20]構(gòu)建合成番茄紅素釀酒酵母時(shí),發(fā)現(xiàn)增加胞內(nèi)脂滴的表達(dá)量可以提升番茄紅素的產(chǎn)量,推測與番茄紅素有著類似性質(zhì)的玉米黃質(zhì)也可以通過相同的方式降低細(xì)胞毒性進(jìn)而增加產(chǎn)量。

本文以本實(shí)驗(yàn)室的釀酒酵母YPH499-YthmgI為出發(fā)菌株,整合本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的番茄紅素合成途徑后將外源的CrtYB和CrtZ整合得到產(chǎn)玉米黃質(zhì)菌株。在得到產(chǎn)玉米黃質(zhì)釀酒酵母后過表達(dá)脂質(zhì)體表達(dá)相關(guān)基因再通過補(bǔ)料優(yōu)化提升了產(chǎn)玉米黃質(zhì)釀酒酵母在發(fā)酵罐中的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

本文使用的所有菌株、質(zhì)粒、引物見表1～表3。

表1 本研究使用菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本實(shí)驗(yàn)使用質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

表3 本實(shí)驗(yàn)使用引物Table 3 Primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)大腸桿菌所用培養(yǎng)基為LB(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 10;培養(yǎng)釀酒酵母所用培養(yǎng)基為YPD(g/L):酵母粉 10,蛋白胨20,葡萄糖20。

1.1.3 母液配制

抗生素母液:氨芐青霉素、硫酸諾爾斯菌素、潮霉素、遺傳霉素母液質(zhì)量濃度分別按照500、100、100、500 mg/mL配制,以0.1%(體積分?jǐn)?shù))添加于培養(yǎng)基中。

1.1.4 酶與試劑盒

2×TaqPCR Master Mix、Phanta?Max Super-Fidelity DNA polymerase、FastPure Plasmid Mini Kit,諾唯贊生物科技(南京)有限公司;Fast DigestedTM、Solution 1,賽默飛世爾科技公司;T4 DNA Ligase,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌表達(dá)盒的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)中選用來源于紅法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)的番茄紅素折疊酶基因CrtYB(AAO73816.1)以及來源于玉米細(xì)菌性枯萎病菌(Pantoeastewartii) β-胡蘿卜素羥化酶基因CrtZ(PANA_RS21155),按照釀酒酵母密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化并規(guī)避常用酶切位點(diǎn),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表達(dá)盒的構(gòu)建:1)分別以質(zhì)粒PUC57-CrtYB、PUC57-CrtZ和pY26為模板擴(kuò)增CrtYB、CrtZ和ADH1終止子片段。以本實(shí)驗(yàn)室保藏的釀酒酵母YPH499基因組為模板,擴(kuò)增GAL1pr、TEFpr啟動(dòng)子及YHR210C基因的開放閱讀框(open reading frame,ORF)和上下游同源臂。2)通過融合PCR將GAL1pr、TEFpr、CrtYB、CrtZ和tADH1終止子鏈接在一起,使用TA鏈接法將表達(dá)盒子連接在19T(simple)載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中進(jìn)行PCR驗(yàn)證。3)利用TA連接將靶點(diǎn)YHR210C連帶其左右同源臂連接到載體Vector 19T(simple)上,反向PCR擴(kuò)增連帶左右同源臂的載體片段;4)挑取步驟2)驗(yàn)證的菌落接入液體LB培養(yǎng)基,于37 ℃,200 r/min過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并酶切純化得到目的片段,將該片段與步驟3)擴(kuò)增出的攜帶同源臂的載體轉(zhuǎn)化至JM109,進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

1.2.2 轉(zhuǎn)化及篩選方法

本研究利用同源重組的方法進(jìn)行基因整合,利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將線性化重組片段轉(zhuǎn)入細(xì)胞,利用同源重組的機(jī)制完成整合,利用表達(dá)盒子攜帶的遺傳霉素抗性標(biāo)簽進(jìn)行重組菌株篩選,將完成轉(zhuǎn)化的菌液涂布至遺傳霉素抗性YPD平板上,倒置于30 ℃培養(yǎng)箱至長出轉(zhuǎn)化子,經(jīng)菌落PCR初步篩選,再通過基因組測序驗(yàn)證后獲得整合表達(dá)菌株。

1.2.3 重組菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

搖瓶培養(yǎng):挑取轉(zhuǎn)化完成的菌落接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中,30 ℃,220 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長中期,即OD值為0.6～0.8,以10%的接種量接至含50 mL培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,30 ℃,220 r/min進(jìn)行培養(yǎng),定時(shí)取樣對(duì)重組菌生長趨勢及胞內(nèi)合成玉米黃質(zhì)水平進(jìn)行測定。

發(fā)酵罐培養(yǎng):挑取轉(zhuǎn)化完成的菌落接種至含50 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,48 h后挑選生長狀況較好的作為種子液。培養(yǎng)條件:溫度30 ℃,pH值為6.5,攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min。

1.2.4 生長趨勢測定及玉米黃質(zhì)提取

取2 mL發(fā)酵液備用,其中1 mL菌液離心并棄上清液,再使用ddH2O洗滌兩次后烘至恒重,稱量并計(jì)算菌體量。剩余1 mL菌液同樣離心洗滌,先加入不小于菌體體積的直徑為0.5 mm的玻璃珠,再加入1 mL 氯仿并標(biāo)記液面高度,振蕩10 min使菌體充分破碎,使用錫紙包裹后靜置過夜,萃取其中的產(chǎn)物。待菌體顏色褪去后提取溶液過膜。在處理樣品的過程中盡量避光防止產(chǎn)物氧化造成損失,存放時(shí)也需要放置在陰涼避光的位置。

1.2.5 檢測方法

實(shí)驗(yàn)中使用島津20A HPLC,Hypersil ODS-2液相色譜柱,流動(dòng)相選擇V(乙腈)∶V(水)=95∶5,流速1 mL/min,柱溫35 ℃,檢測波長450 nm,進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米黃質(zhì)合成途徑的構(gòu)建與發(fā)酵

本文中構(gòu)建的表達(dá)盒子如圖3所示,利用已經(jīng)敲除Gal80的釀酒酵母YPH499-tHMG1為出發(fā)菌株。敲除Gal80后GAL啟動(dòng)子不再受半乳糖的誘導(dǎo),但仍受到葡萄糖的部分抑制。表現(xiàn)為前期葡萄糖濃度較高,產(chǎn)物合成基因受到抑制,主要積累菌體,后期葡萄糖濃度下降大量積累產(chǎn)物。將β-胡蘿卜素羥化酶(CrtZ)和雙功能八氫番茄紅素合酶/番茄紅素環(huán)化酶(CrtYB)組成的玉米黃質(zhì)合成表達(dá)盒子轉(zhuǎn)化至YPH499-tHMG1,替換YHR210C的ORF,之后提取基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測序驗(yàn)證,結(jié)果表明重組菌成功構(gòu)建。

圖3 玉米黃質(zhì)的合成途徑的表達(dá)盒子結(jié)構(gòu)Fig.3 Metabolic engineering pathway expression box of zeaxanthin

在YPD培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)72 h,發(fā)現(xiàn)玉米黃質(zhì)在60 h積累量最高,為3.4 mg/L,單位細(xì)胞產(chǎn)量為0.58 mg/g CDW(圖4)。發(fā)酵60 h以后,產(chǎn)物玉米黃質(zhì)的產(chǎn)量急劇下降,可能的原因是產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性,影響細(xì)胞生長,并進(jìn)一步影響產(chǎn)物在胞內(nèi)的積累。因此,提高釀酒酵母對(duì)玉米黃質(zhì)的耐受性應(yīng)該可以增加玉米黃質(zhì)的積累量。

圖4 玉米黃質(zhì)產(chǎn)量及菌體量變化Fig.4 Changes of zeaxanthin yield and bacterial biomass

2.2 利用脂質(zhì)體含量提高的重組酵母提高玉米黃質(zhì)的積累

類胡蘿卜素都具有較好的脂溶性,增加釀酒酵母的脂質(zhì)體表達(dá)可以讓玉米黃質(zhì)溶解在脂質(zhì)載體中。李方迪等[20]通過過量積累釀酒酵母中的脂質(zhì)載體,將番茄紅素的產(chǎn)量提高1.7倍,通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)番茄紅素積累在脂質(zhì)體上。玉米黃質(zhì)與番茄紅素同屬萜類化合物,推測脂質(zhì)體的過表達(dá)對(duì)玉米黃質(zhì)在釀酒酵母中的積累也有類似的作用。因此,利用本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的過表達(dá)脂質(zhì)載體的釀酒酵母tHMG1-19,整合上述合成玉米黃質(zhì)合成酶得到菌株19-09-zea-IB/IE。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明60 h時(shí)的玉米黃質(zhì)積累到5 mg/L,此時(shí)菌體量為3.3 g/L(圖5-a)。搖瓶發(fā)酵24 h后每24 h補(bǔ)加0.8 mL 500 g/L的葡萄糖,玉米黃質(zhì)的積累如圖5-b所示,玉米黃質(zhì)產(chǎn)量提高到16 mg/L,此時(shí)的菌體量為5.3 g/L。

a-未補(bǔ)加葡萄糖時(shí);b-補(bǔ)加葡萄糖時(shí)

2.3 補(bǔ)加半乳糖發(fā)酵產(chǎn)玉米黃質(zhì)釀酒酵母

GAL作為玉米黃質(zhì)合成酶在表達(dá)時(shí)利用的啟動(dòng)子,受到半乳糖調(diào)控,半乳糖濃度提高,GAL啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度也會(huì)相應(yīng)提高,因此嘗試使用半乳糖代替葡萄糖作為補(bǔ)料碳源進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),結(jié)果如圖6所示。菌體生長狀態(tài)相比補(bǔ)加葡萄糖有較大的區(qū)別,玉米黃質(zhì)產(chǎn)量在72 h最高,為8 mg/L,此時(shí)的細(xì)胞菌體量為4.9 g/L。但在補(bǔ)加葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,玉米黃質(zhì)產(chǎn)量在此后仍有較大幅度的提高。此外,本實(shí)驗(yàn)室已有研究中發(fā)現(xiàn),流加乙醇作為碳源能有效提高番茄紅素的積累[20],因此本研究中也嘗試使用分批補(bǔ)加乙醇的方式進(jìn)行發(fā)酵,在發(fā)酵培養(yǎng)24 h后每24 h補(bǔ)加1 mL 37.5%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇。結(jié)果如圖6-b所示,玉米黃質(zhì)產(chǎn)量在96 h最高,僅為2.6 mg/L,此時(shí)的菌體量僅有3 g/L。因此本研究采用流加葡萄糖的方法進(jìn)行下一步上罐實(shí)驗(yàn)。

a-補(bǔ)加半乳糖;b-補(bǔ)加乙醇

2.4 5 L罐發(fā)酵培養(yǎng)重組釀酒酵母生產(chǎn)玉米黃質(zhì)

菌株19-09-zea-IB/IE在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。分別24、36、48、60 h開始以2.5 g/h的速度恒速流加葡萄糖,發(fā)酵的總時(shí)長為168 h。對(duì)玉米黃質(zhì)產(chǎn)量、菌體生長情況進(jìn)行測定,如圖7所示,不同時(shí)間開始補(bǔ)加葡萄糖時(shí),都檢測到了乙醇和葡萄糖在后期的積累。從24、36、48 h 開始流加葡萄糖,玉米黃質(zhì)分別在168、144、144 h產(chǎn)量最高,分別為32.5、38.3、42.3 mg/L。60 h開始流加玉米黃質(zhì)產(chǎn)量急劇下降,細(xì)胞菌體量也有明顯降低,因此選取48 h為起始流加時(shí)間。

a-玉米黃質(zhì)產(chǎn)量;b-菌體量

進(jìn)一步嘗試采用指數(shù)流加的方式維持酵母細(xì)胞的持續(xù)生長,進(jìn)而獲得更高的產(chǎn)物積累和菌體量。根據(jù)之前的發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)計(jì)算得出在本次研究中應(yīng)用在發(fā)酵罐上的指數(shù)流加參數(shù)分別為μ=0.028 8 h-1,k0=0.006 L/h,流加起始時(shí)間為48 h,葡萄糖質(zhì)量濃度250 g/L。玉米黃質(zhì)的產(chǎn)量以及菌體量如圖8所示。玉米黃質(zhì)產(chǎn)量在144 h最高達(dá)到47.7 mg/L,菌體量為6.5 g/L,相比48 h開始恒速流加葡萄糖時(shí)的玉米黃質(zhì)產(chǎn)量有所提高,因此利用指數(shù)流加的方法對(duì)釀酒酵母合成玉米黃質(zhì)更為有效。

a-玉米黃質(zhì)產(chǎn)量以及菌體量;b-罐內(nèi)物質(zhì)積累量

3 結(jié)論與討論

釀酒酵母適于生產(chǎn)玉米黃質(zhì)。已有研究表明,一些微生物能夠積累大量的脂質(zhì)載體,產(chǎn)物附著其上能夠降低對(duì)細(xì)胞的毒性[14]。本研究利用前期構(gòu)建的脂質(zhì)體積累工程菌,使產(chǎn)物玉米黃質(zhì)的產(chǎn)量提高1.5倍。以葡萄糖為碳源進(jìn)行補(bǔ)料,發(fā)現(xiàn)48 h開始補(bǔ)料產(chǎn)量最高。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn),優(yōu)化了補(bǔ)料方法,以指數(shù)流加方式維持酵母細(xì)胞的進(jìn)一步持續(xù)生長和產(chǎn)物的積累,最終玉米黃質(zhì)產(chǎn)量在144 h最高,達(dá)到47.7 mg/L,此時(shí)菌體質(zhì)量濃度為6.5 g/L。

目前,國內(nèi)外對(duì)玉米黃質(zhì)生產(chǎn)的研究較少,普遍產(chǎn)量較低。本研究發(fā)現(xiàn)即使以指數(shù)流加的方式進(jìn)行葡萄糖補(bǔ)料,達(dá)到的最高菌體量依舊較低。因此,玉米黃質(zhì)產(chǎn)量不高的主要瓶頸在于菌體濃度過低。由于YPH499是多重氨基酸營養(yǎng)缺陷型菌株,雖然實(shí)驗(yàn)采用YPD完全培養(yǎng)基,但其氨基酸含量可能仍然低于細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成所需,因此后續(xù)可以通過敲入缺失的氨基酸合成必需基因,使其成為非營養(yǎng)缺陷型菌株,并進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基、補(bǔ)料策略等,提高重組菌玉米黃質(zhì)的產(chǎn)量。