孫孟琦,楊化宇,閆博文*,張娜娜,范大明

1(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

全蛋液的傳統(tǒng)巴氏殺菌過程主要以傳導(dǎo)加熱為主,為保證管路中心達(dá)到蛋液殺菌溫度,會(huì)導(dǎo)致管壁區(qū)域物料的過度加熱并造成熱量冗余。高強(qiáng)度熱處理會(huì)使全蛋液中熱敏性蛋白質(zhì)變性,致使全蛋液的功能特性受損、品質(zhì)劣變。此外,管路內(nèi)部溫度梯度方向也加劇了管路結(jié)焦現(xiàn)象的發(fā)生,從而導(dǎo)致管路清洗難度增大和能效降低等問題。在保障微生物安全性的前提下,降低熱敏蛋白質(zhì)在巴氏殺菌處理過程中的熱損傷程度,對(duì)全蛋液的加工及在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用尤為重要。

微波作為一種新型的物理場(chǎng)加工方式,憑借其體積式靶向加熱原理,能夠?qū)崿F(xiàn)無需傳熱介質(zhì)的選擇性加熱過程,在縮短熱處理時(shí)間的同時(shí)可以針對(duì)性的改善傳統(tǒng)巴氏殺菌方法的缺陷。微波的冷熱點(diǎn)現(xiàn)象一直是影響其進(jìn)一步應(yīng)用與發(fā)展的障礙。連續(xù)式微波熱處理通過改善內(nèi)部電磁場(chǎng)分布情況,可以有效改善溫度分布均勻性,減少熱失控[1-2]。目前連續(xù)式微波巴氏殺菌技術(shù)的研究多集中在牛奶和果汁上,盡管在一定程度上證明了其商業(yè)可行性,但連續(xù)式微波巴氏殺菌技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還處于起步階段,鮮有適用于流體食品的實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)規(guī)模的連續(xù)式微波處理系統(tǒng);針對(duì)不同類型食品的微波巴氏殺菌方法的工藝開發(fā)并不充分;亦缺乏全蛋液的連續(xù)式微波殺菌的研究,對(duì)于殺菌效果和熱敏蛋白質(zhì)的影響還需要進(jìn)一步探究[3]。

因此,本研究首先構(gòu)建了全蛋液的連續(xù)式微波巴氏殺菌系統(tǒng),探究了不同微波功率-溫度組合下的微生物致死效果、微波殺菌動(dòng)力學(xué)及全蛋液蛋白質(zhì)變化,全蛋液微波巴氏殺菌的研究有助于解決傳統(tǒng)巴氏殺菌方法的痛點(diǎn),為工業(yè)生產(chǎn)提供導(dǎo)向性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

全蛋液,蘇州歐福蛋業(yè)股份有限公司;生雞蛋,北京正大蛋業(yè)有限公司;大腸桿菌CGMCC1.8745、金黃色葡萄球菌CGMCC1.1861、沙門氏菌CICC21482,保藏于江南大學(xué)生物技術(shù)中心。

1.1.2 試劑

去離子水,無錫華晶飄之霖有限公司;Tris、甘氨酸、8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DTNB,美國西格瑪奧德里奇有限公司;BCA蛋白濃度增強(qiáng)型測(cè)定試劑盒,賽默飛世爾科技有限公司;LB、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violet red bile agar,VRBA)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽(xylose lysine desoxycholate,XLD)、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptone soy broth,TSB)培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-3600紫外分光光度計(jì),日本Shimazu公司;F-7000熒光光譜儀,美國HORIBA公司;FX36型高速乳化均質(zhì)機(jī),德國弗魯克公司;XO-SM400微波反應(yīng)體系,南京先歐儀器制造有限公司;WT600-2J蠕動(dòng)泵,蘇州諾方科精密設(shè)備有限公司;FOT-L-SD光纖溫度傳感器,加拿大FISO公司;MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋,三洋電子有限公司;BSC-1000 A2生物安全柜,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;ZQZY-HC型振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋液原料制備

活化后菌液離心5 min(6 000×g,4 ℃),菌泥重新懸浮于全蛋液中,使樣品中的菌體濃度達(dá)到107～108CFU/mL,用于殺菌實(shí)驗(yàn)。用低速攪拌器對(duì)生雞蛋進(jìn)行均質(zhì)處理,過80目篩網(wǎng)除雜,得到新鮮均一的全蛋液用于品質(zhì)特性實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 微波巴氏殺菌系統(tǒng)構(gòu)建

如圖1所示,體系主要包括:原料桶、磁力攪拌器、蠕動(dòng)泵、微波腔體(0.5 m×0.5 m×0.5 m)、4個(gè)矩形波導(dǎo)及磁控管、硅膠管、溫度傳感器、水浴鍋、酒精燈等。管路內(nèi)徑為0.010 m,外徑為0.015 m,螺旋管匝數(shù)為3.5,直徑為0.130 m,螺距為0.030 m。微波腔內(nèi)管路的有效長度為2.56 m。為了建立微波加熱的穩(wěn)態(tài)流動(dòng)條件,全蛋液在體系中預(yù)循環(huán)一段時(shí)間后開啟微波,通過調(diào)節(jié)流速和微波功率使蛋液達(dá)到所需殺菌溫度(56、60、64 ℃),腔體出口處設(shè)置取樣點(diǎn),當(dāng)?shù)耙哼_(dá)到所需溫度時(shí)立即取樣,迅速置于水浴鍋中密封保溫處理(1、2、3 min),隨后置于冰水浴中冷卻。試驗(yàn)中所使用的器材均經(jīng)過滅菌處理,取樣處放置酒精燈保證無菌環(huán)境,所有接種、涂布等操作步驟均在生物安全柜中進(jìn)行。6組微波巴氏殺菌條件LPT 56 ℃、LPT 60 ℃、LPT 64 ℃、HPT 56 ℃、HPT 60 ℃和HPT 64 ℃對(duì)應(yīng)流速分別為0.146、0.131、0.119、0.292、0.263、0.239 m/s。低功率微波巴氏殺菌(low power treatment,LPT)和高功率微波巴氏殺菌(high power treatment,HPT)分別指實(shí)驗(yàn)所用微波功率密度8 W/mL和16 W/mL,56、60、64 ℃指殺菌溫度,例如LPT 56 ℃指的是在8 W/mL的微波功率密度下使蛋液樣品達(dá)到56 ℃的處理?xiàng)l件,RAW指未處理全蛋液。

圖1 微波巴氏殺菌系統(tǒng)原理圖Fig.1 Schematic diagram of the microwave pasteurization system

1.3.3 微生物培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

根據(jù)GB 4789.1—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則》進(jìn)行微生物的培養(yǎng)與計(jì)數(shù),培養(yǎng)基選擇:大腸桿菌-VRBA;沙門氏菌-XLD;金黃色葡萄球菌-TSB。

1.3.4 殺菌動(dòng)力學(xué)

殺菌動(dòng)力學(xué)的計(jì)算如公式(1)～公式(4)所示:

Log-Logistic模型[4]:

(1)

Log-linear+Shoulder模型[5]:

(2)

Log-linear+Tail模型[6]:

log10(N)=log10{[10log10(N0)-10log10(Nres)]× e(-kmax×t)+10log10(Nres)}

(3)

用均方根誤差(root mean square error,RMSE)和R2來評(píng)價(jià)殺菌動(dòng)力學(xué)模型的預(yù)測(cè)優(yōu)度:

(4)

式中:α,曲線上漸近線,lg CFU/mL;ω,曲線下漸近線,lg CFU/mL;σ,最大失活速率,min-1;τ,最大失活速率對(duì)應(yīng)殺菌時(shí)間的對(duì)數(shù)值;kmax,曲線對(duì)數(shù)線性部分的失活率,min-1;Sl,肩長,min;log10(N0),初始菌群預(yù)測(cè)對(duì)數(shù),CFU/mL;log10(Nres),剩余菌群預(yù)測(cè)對(duì)數(shù),CFU/mL;n,觀測(cè)值的數(shù)量,個(gè)。

1.3.5 溶解度測(cè)定

樣品離心15 min(10 000×g,4 ℃),取上清液和原樣進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定,溶解度的計(jì)算如公式(5)所示[7]:

(5)

1.3.6 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

首先用PBS(0.01 mol/L,pH 7.2)將樣品稀釋到0.5 mg/mL。激發(fā)和發(fā)射波長分別設(shè)定為280、300～500 nm,狹縫寬5 nm,掃描速度1 200 nm/min。PBS(0.01 mol/L,pH 7.2)作為空白對(duì)照[8]。

1.3.7 表面疏水性測(cè)定

用ANS熒光探針法對(duì)表面疏水性進(jìn)行測(cè)定,用外源熒光強(qiáng)度大小來表示疏水性大小。取40 μL的8.0 mmol/L ANS溶液加入4 mL的稀釋后的樣品溶液中。室溫下避光孵育20 min后進(jìn)行熒光掃描。激發(fā)及發(fā)射波長分別為390、400 nm,狹縫寬5 nm,掃描速度1 200 nm/min[9]。

1.3.8 游離巰基含量測(cè)定

將樣品與Tris-甘氨酸緩沖液以體積比1∶3混勻,加入40 μL Ellman試劑混勻,25 ℃水浴保溫30 min后測(cè)定吸光度。Ellman試劑用作空白對(duì)照[10],游離巰基含量測(cè)定的計(jì)算如公式(6)所示:

(6)

式中:A412為412 nm處吸光度;ρ為樣品質(zhì)量濃度,mg/mL;D為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式記錄。使用Origin 2018C進(jìn)行繪圖,SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Duncan’s multiple range test分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波巴氏殺菌動(dòng)力學(xué)分析

螺旋連續(xù)式微波巴氏殺菌系統(tǒng)可以避免因電磁場(chǎng)分布不均勻和微波穿透深度短引起的加熱不均勻現(xiàn)象,有效改善傳質(zhì)傳熱速率和溫度分布均勻性,實(shí)現(xiàn)對(duì)全蛋液的均勻高效加熱[11-12]。微波巴氏殺菌升溫迅速,可在50 s內(nèi)到達(dá)穩(wěn)態(tài)(圖2)。不同微波巴氏殺菌條件下大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的存活率分別降低3.84～5.85 log10、4.11～6.19 log10和3.11～5.54 log10。金黃色葡萄球菌對(duì)巴氏殺菌處理的抗性略高于大腸桿菌和沙門氏菌,可能與革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌在結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁分子組織上的差異有關(guān),革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁上較厚的肽聚糖結(jié)構(gòu)可以抑制失活[13]。

圖2 微波巴氏殺菌處理升溫曲線Fig.2 Temperature-rising curve of microwave pasteurization treatments

傳統(tǒng)一級(jí)線性動(dòng)力學(xué)模型只與時(shí)間相關(guān),認(rèn)為存活曲線呈線性趨勢(shì),然而非等溫微波巴氏殺菌過程中,存活曲線呈現(xiàn)明顯的非線性趨勢(shì)(圖3),這會(huì)導(dǎo)致使用線性模型擬合可能發(fā)生致死率過高或過低程度的預(yù)測(cè),不能準(zhǔn)確描述微生物的失活行為,因而本文使用3種非線性模型進(jìn)行回歸擬合分析[4-5]。圖4～圖6可以看出,Log-Logistic模型具有最好的擬合精度和穩(wěn)定性(R2:0.998～0.999,RMSE:0.002～0.072),其次是Log-linear+Tail模型(R2:0.982～0.999,RMSE:0.026～0.298),Log-linear+Shoulder模型擬合效果相對(duì)較差(R2:0.980～0.999,RMSE:0.041～0.314)。本研究中存活曲線出現(xiàn)輕微拖尾現(xiàn)象,可能是由于較高耐熱性的微生物細(xì)胞亞群的存在[14-15]。

a-大腸桿菌;b-沙門氏菌;c-金黃色葡萄球菌

a-大腸桿菌;b-沙門氏菌;c-金黃色葡萄球菌

a-大腸桿菌;b-沙門氏菌;c-金黃色葡萄球菌

a-大腸桿菌;b-沙門氏菌;c-金黃色葡萄球菌

2.2 微波巴氏殺菌對(duì)全蛋液蛋白質(zhì)的影響

2.2.1 微波巴氏殺菌對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響

如表1所示,相較于未處理樣品,微波巴氏殺菌并未使全蛋液的蛋白質(zhì)溶解度降低。LPT處理下,蛋白質(zhì)溶解度顯著提高(P<0.05),功率密度相同處理溫度不同的組別溶解度無顯著差異(P>0.05),HPT處理下樣品溶解度略低于LPT處理,但與未處理樣品相比溶解度無顯著差異(P>0.05)。

表1 微波巴氏殺菌全蛋液蛋白質(zhì)溶解度Table 1 Solubility of proteins in liquid whole egg under microwave pasteurization treatments

2.2.2 微波巴氏殺菌對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)熒光光譜圖的變化有效表征其三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。內(nèi)源熒光光譜利用蛋白質(zhì)自身具有的發(fā)色基團(tuán)來檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化[16],微波處理后樣品的最大波長藍(lán)移,表明微波處理影響了內(nèi)部微環(huán)境的極性(圖7)。微波處理后全蛋液樣品的熒光強(qiáng)度降低,可能是由于微波促使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部包埋的色氨酸殘基暴露在強(qiáng)極性水溶液中,微環(huán)境極性增加,激發(fā)態(tài)和基態(tài)顯色基團(tuán)的能量受影響,從而造成本征熒光強(qiáng)度降低。

圖7 微波巴氏殺菌全蛋液蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜Fig.7 Endogenous fluorescent spectrometry of proteins in liquid whole egg under microwave pasteurization treatments

2.2.3 微波巴氏殺菌對(duì)蛋白質(zhì)表面疏水性的影響

如圖8所示,微波巴氏殺菌處理后全蛋液樣品的外源熒光強(qiáng)度增加,說明微波巴氏殺菌處理促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子展開,埋藏在分子內(nèi)部的疏水鏈暴露,表面疏水性增加,有利于功能特性的改善[17]。

圖8 微波巴氏殺菌全蛋液蛋白質(zhì)表面疏水性Fig.8 Surface hydrophobicity of proteins in liquid whole egg under microwave pasteurization treatments

2.2.4 微波巴氏殺菌對(duì)巰基含量的影響

巰基在蛋白質(zhì)的凝膠、泡沫等特定結(jié)構(gòu)的形成中起重要作用[7]。與未處理樣品相比(表2),微波巴氏殺菌處理后的全蛋液樣品巰基含量呈上升趨勢(shì),隨著微波功率和處理溫度的增加,巰基含量整體呈增加趨勢(shì)(P<0.05)。可能是由于微波巴氏殺菌處理使蛋白質(zhì)去折疊或離子化程度有所增加,游離巰基暴露,巰基含量增加[18-19]。

表2 微波巴氏殺菌全蛋液蛋白質(zhì)巰基含量Table 2 Sulfhydryl contents of proteins in liquid whole egg under microwave pasteurization treatments

3 結(jié)論與討論

本文研究了全蛋液的微波巴氏殺菌,探究了不同微波功率-溫度組合下的微生物致死效果、微波殺菌動(dòng)力學(xué)及全蛋液蛋白質(zhì)變化,具體內(nèi)容如下:

a)微波巴氏殺菌升溫時(shí)間短,可以有效縮短全蛋液在巴氏殺菌過程中的非等溫加熱滯后期。通過對(duì)微波功率密度及殺菌溫度的調(diào)控,微波巴氏殺菌可以使大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌存活率降低5 log10以上,殺菌效果顯著。

b)非線性模型是擬合非等溫微波巴氏殺菌過程的有效模型(R2≥0.980,RMSE≤0.314)。Log-Logistic模型擬合精度和穩(wěn)定性最好,Log-linear+Tail模型擬合效果好且變量少。模型擬合結(jié)果與存活曲線趨勢(shì)呈現(xiàn)良好的一致性,進(jìn)一步證明非線性模型的準(zhǔn)確性和有效性。

c)微波誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子適度展開,更多帶電和極性基團(tuán)暴露,溶解度有所提高,游離巰基含量增加,有利于全蛋液品質(zhì)特性的改善。

微波巴氏殺菌針對(duì)性地彌補(bǔ)了全蛋液傳統(tǒng)巴氏殺菌方法的缺陷,通過降低高溫處理時(shí)間和熱加工程度,減少全蛋液在熱敏溫度下的停留時(shí)間,降低蛋白質(zhì)熱損傷程度,有助于全蛋液品質(zhì)的改善以及在食品加工領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。全蛋液微波巴氏殺菌的研究有助于解決傳統(tǒng)巴氏殺菌方法的痛點(diǎn),為工業(yè)生產(chǎn)提供導(dǎo)向性。連續(xù)式微波加熱模式的開發(fā)以及在全蛋液殺菌領(lǐng)域中的應(yīng)用,對(duì)黏稠態(tài)熱敏性流體食品高效微波熱處理技術(shù)的開發(fā)具有重要意義。